Etude de la localisation subcellulaire de VAD1

La détermination de la localisation tissulaire, cellulaire et subcellulaire de VAD1 est un point important permettant d’obtenir des données supplémentaires quant à la fonction de VAD1. Cela permettrait aussi de répondre à certaines questions : la protéine VAD1 est-elle une protéine membranaire ou une protéine soluble, joue-t-elle un rôle au niveau de compartiments cellulaires spécifiques ? C’est pourquoi différentes approches ont été utilisées. Tout d’abord, une analyse in silico a été réalisée par l’utilisation de logiciels de prédiction de localisation, puis des expériences d’expression de protéines de fusion entre VAD1 et la GFP ont été réalisées in planta.

II.1. Analyse in silico

Pour réaliser cette analyse, différents logiciels de prédiction de localisation subcellulaire disponibles sur internet ont été utilisés (Tableau 4). Comme décrit précédemment, 2 formes de la protéine VAD1 contenant le domaine GRAM sont trouvées dans les banques de données, une forme possédant un domaine transmembranaire et un domaine coil-coiled (forme longue), et une forme ne les possédant pas (forme courte). Ces 2 formes différentes ont été étudiées et leur localisation a été prédite à l’aide des différents logiciels de prédiction disponibles sur le site www.expasy.ch/tools/#similarity et http://aramemnon.botanik.uni- koeln.de/. Tout d’abord, la forme longue de VAD1 possédant un domaine transmembranaire, constitué par les acides aminés situés entre la position 508 et 528, est donnée pour être membranaire (logiciels SOSUI, TMHMM). De plus, la partie N-terminale de la protéine serait orientée vers l’extérieur de la membrane, et la partie C-terminale vers l’intérieur (logiciel TMHMM). Il apparaît que la forme longue pourrait être une protéine présente au niveau de plastes (Predotar), et particulièrement au niveau des chloroplastes (ChloroP, TargetP). Ces 2 derniers logiciels indiquent qu’un peptide de transit pour un adressage vers les chloroplastes semblent exister au niveau de la partie N-terminale de la protéine. De même, les logiciels PCLR et SLP-local prédisent une localisation chloroplastique. Cependant, d’autres logiciels prédisent une localisation différente. Les résultats obtenus avec logiciel WolfPSORT suggérent, avec la probabilité la plus forte, une localisation nucléaire, avec cependant 2 probabilités également fortes pour le réticulum endoplasmique et les chloroplastes. Le logiciel Multiloc prédit une localisation cytoplasmique. De plus, le logiciel PSORT prédit une localisation au niveau chloroplastique, mais aussi une possibilité pour le noyau. Les résultats obtenus avec d’autres logiciels comme PTS1 et Mitoprot permettent de penser que VAD1 ne serait pas une protéine ciblée au niveau des péroxysomes et au niveau des mitochondries.

Figure 38 : Etude de la localisation subcellulaire de VAD1.

A, B : Observation en microscopie photonique en fluorescence de la GFP (A) et en lumière visible

(B) de feuilles de Nicotiana benthamiana infiltrées avec une souche d’Agrobacterium tumefaciens contenant la construction pVAD1::GFP::VAD1g.

C, D, E, F : Expériences de co-localisation par observation en microscopie confocale en

fluorescence de la RFP (révélant le marqueur chloroplastique cRecA) (C), de la chlorophylle (D), de la GFP (E) et en lumière visible (F) de feuilles de Nicotiana benthamiana infiltrées avec une souche d’Agrobacterium tumefaciens contenant la construction pVAD1::GFP::VAD1g.

Barres : 10 µm.

Stomates

A B

C D

L’analyse de la localisation putative de la forme courte de VAD1 montre que VAD1 serait une protéine soluble (SOSUI, TMHMM). Malgré cette différence importante avec la forme longue, les résultats obtenus révèlent des localisations prédites qui sont les mêmes que celles obtenues avec la forme longue, avec une plus forte probabilité pour une localisation au niveau des chloroplastes.

L’ensemble des données obtenues in silico restent peu informatives. En effet, elles suggèrent que VAD1 ne semble pas être localisée ni au niveau des péroxisomes ni au niveau des mitochondries. De plus, la protéine VAD1 ne possédant pas de peptide de signal d’adressage vers le noyau, elle ne semble pas non plus être localisée au niveau du noyau. Cependant, cette possibilité ne peut être exclue, un logiciel prédisant une localisation nucléaire. Il apparaît de plus que les compartiments du réticulum endoplasmique et du Golgi ne semblent pas être les compartiments d’adressage de la protéine VAD1. La majorité des logiciels utilisés prédit une localisation au niveau de plastes, en particulier les chloroplastes. Cependant, on ne peut exclure que la protéine VAD1 puisse être également une protéine soluble qui ne serait pas trouvée au niveau de membranes, d’une part car il est possible qu’une forme de VAD1 délétée de son domaine transmembranaire existe, et d’autre part car un logiciel prédit une localisation cytoplasmique. Dans ce cas, il est possible d’envisager que la protéine VAD1 pourrait avoir des fonctions différentes selon sa localisation subcellulaire.

II.2. Etude de la localisation tissulaire, cellulaire et

subcellulaire de VAD1 in planta

II.2.1. Analyse de la localisation de VAD1 par des expériences

d’expression transitoire chez Nicotiana benthamiana.

Afin de déterminer la localisation subcellulaire de VAD1, l’une des approches développées a été de transformer transitoirement des feuilles du système hétérologue

Nicotiana benthamiana, comme décrit précédemment pour l’analyse des lignées

surexprimant VAD1. Des feuilles ont été infiltrées et transformées avec des souches d’Agrobacterium tumefaciens contenant, pour l’une d’elles, le gène de VAD1 fusionné au gène codant la GFP dans sa partie N-terminale et placé sous le contrôle du promoteur de

VAD1 (construction pVAD1::GFP::VAD1g), et pour l’autre, le marqueur cRecA (Khazi et al.,

2003) spécifiquement exprimé au niveau des chloroplastes fusionné à la RFP. Les observations en microscopie photonique à fluorescence montrent un marquage à la GFP au niveau des membranes (de nature inconnue) des stomates (Figure 38A). Dans le but de déterminer la localisation subcellulaire de VAD1, des expériences de co-localisation en microscopie confocale ont été réalisées en co-infiltrant des feuilles avec des souches d’Agrobacterium tumefaciens contenant la construction pVAD1::GFP::VAD1g et contenant le

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marqueur cRecA, spécifiquement exprimé au niveau des chloroplastes. Les observations révèlent que seuls les chloroplastes apparaissent fluorescents après excitation de la RFP (Figure 38C). Cependant, tous les chloroplastes des cellules ne sont pas marqués. L’excitation de la GFP révèle une fluorescence spécifiquement au niveau de membranes des stomates de la feuille (Figure 38E). Néanmoins, il est difficile de conclure quand à la nature des membranes marquées à la GFP (il est toutefois possible que ces membranes soient les membranes plasmiques des stomates). Ces observations devront être confirmées par des expériences de co-localisation avec d’autres marqueurs des membranes, comme par exemple des marqueurs de la membrane plasmique. Il est aussi possible que la fluorescence observée au niveau des stomates soit localisée au niveau d’autres membranes et il ne faut pas exclure que ces membranes pourraient être des membranes des chloroplastes ou d’autres organites. En effet, comme déjà mentionné en expression transitoire, tous les chloroplastes des cellules transformées ne fluorescent pas après excitation de la RFP.

II.2.2. Analyse de la localisation de VAD1 dans des lignées

transgéniques d’Arabidopsis

Des plantes de la lignée parentale sauvage Ws-4 ont été transformées avec les différentes constructions permettant la fusion entre VAD1 et la GFP (Figure 34) de manière à déterminer la localisation de la protéine VAD1. Les premières expériences réalisées sur ces plantes n’ont pas permis de mettre en évidence de fluorescence de la GFP.