Phénotype de lignées surexprimant VAD1, après inoculation avec une souche avirulente

Le phénotype des lignées d’Arabidopsis surexpresseurs a été observé suite à une inoculation avec la souche avirulente PstDC3000/avrRpm1 (5x106 _cfu.mL-1_{). Ici sont}

présentés les résultats obtenus sur 3 lignées transgéniques sur 7 testées obtenues après transformation de l’écotype sauvage Ws-4 avec la souche contenant la construction

p35S::VAD1g, sur 3 sur 6 testées lignées avec la construction p35S::VAD1g::GFP et sur 3

lignées sur 8 testées contenant la construction p35S . Ces lignées présentent des niveaux d’expression de VAD1 différents au cours de leur développement, en absence d’agent pathogène (Figure 36A). Les lignées transformées avec la construction contrôle p35S présentent un niveau d’expression similaire à celui observé chez le parent sauvage Ws-4. Les lignées transformées avec la construction p35S::VAD1g présentent des niveaux d’expression de VAD1 différents : 105 fois par rapport au niveau d’expression chez la lignée parentale sauvage pour la lignée p35S::VAD1g-1, 6 fois pour la lignée p35S::VAD1g-4 et 31 fois pour la lignée p35S::VAD1g-6. De même, les lignées p35S::VAD1g::GFP présentent des niveaux d’expression différents : 88 fois pour la lignée p35S::VAD1g::GFP-2, 97 fois pour la lignée p35S::VAD1g::GFP-4 et 61 fois pour la lignée p35S::VAD1g::GFP-5. Ces lignées présentant des niveaux d’expression différents, ont été sélectionnées pour des expériences d’inoculation de manière à déterminer si les phénotypes observés peuvent être corrélés avec le niveau d’expression de VAD1.

Les résultats obtenus montrent que les lignées contenant la construction

p35S::GFP::VAD1g et p35S::VAD1 présentent un délai dans l’apparition des lésions HR,

avec des lésions moins développées 72h après inoculation en comparaison avec la lignée parentale sauvage et avec les lignées possédant la construction témoin p35S (Figure 36B). De plus, les lésions à ce stade de l’expérience présentent un aspect de type chlorotique chez ces lignées, alors que les lésions de type HR (nécrotiques) sont apparues chez la lignée parentale sauvage. Cependant, malgré des niveaux d’expression de VAD1 différents dans les différentes lignées p35S::GFP::VAD1g, il est difficile d’associer les phénotypes

0 1000 2000 3000 PR-1 E xpr es si on r el ativ e VAD1 p35S: :VAD 1g-1 p35S: :VAD 1g-4 p35S: :VAD 1g-6 p35S: :GFP: :VAD 1g-2 p35S: :GFP: :VAD 1g-4 p35S: :GFP: :VAD 1g-5 p35S-1p35S-5p35S-6 Ws -4 B 0 200 400 600

Figure 37 : Expression de PR-1 (A) et de VAD1 (B) déterminée par Q-RT-PCR chez les différentes lignées transgéniques d’Arabidopsis et chez la lignée parentale sauvage Ws-4 au cours d’une inoculation avec la souche avirulente PstDC3000/avrRpm1.

Expression de PR-1 (A) et de VAD1 (B) au temps 0 (barres noires), 9h (barres violettes), 24h (barres vertes) et 48h (barres rouges) après inoculation avec la souche avirulente

PstDC3000/avrRpm1 (5x106 _cfu.ml-1_{). Les niveaux d’expression de PR-1 et VAD1 ont été}

normalisés avec le niveau d’expression de β-tubuline4 et le niveau d’expression chez Ws-4 a été porté à 1. A Ex p ressio n re lat iv e p35S: :VAD 1g-4 p35S: :VAD 1g-6 p35S: :GFP: :VAD 1g-2 p35S: :GFP: :VAD 1g-4 p35S: :GFP: :VAD 1g-5 p35S-1p35S-5p35S-6 Ws -4 p35S: :VAD 1g-1

observés aux niveau d’expression de VAD1, les phénotypes observés étant similaires. Cependant, les niveaux d’expression de VAD1 dans ces lignées sont relativement proches. En revanche, l’analyse des lignées transformées avec la construction p35S::VAD1g démontre que la lignée p35S::VAD1g-2 présente plus de feuilles chlorotiques que la lignée

p35S::VAD1g-6, qui elle-même présente plus de feuilles chlorotiques que la lignée

p35S::VAD1g-5 (données non présentées). Ces observations sont en accord avec les

niveaux d’expression de VAD1. Il apparaît que, dans ces lignées, plus le niveau d’expression de VAD1 est fort, plus les plantes présentent un retard dans le développement des lésions HR.

En parallèle de l’observation phénotypique des lignées surexpresseurs, l’expression du gène marqueur de défense PR-1 a été quantifiée par Q-RT-PCR au cours du temps de après inoculation avec la ssouche PstDC3000/avrRpm1 (Figure 37A). Alors que l’expression de PR-1 présente un maximum à 24h chez la lignée parentale sauvage et les plantes transformées avec la construction contrôle, l’expression de PR-1 est maximum à 48h après inoculation chez les lignées surexpresseurs. Il apparaît donc dans cette expérience que les lignées transformées présentent un retard dans l’accumulation du transcrit de PR-1, ce qui est en accord avec les observations phénotypiques où ces mêmes lignées présentent un retard dans la mise en place de la HR. Cependant, malgré un retard d’accumulation de transcrits du gène marqueur PR-1, le niveau d’expression de celui-ci ne semble pas être affecté chez les lignées surexpresseurs en comparaison avec les lignées contrôles et le parent sauvage Ws-4 (à l’exception de la lignée p35S::GFP::VAD1g-4 qui présente une diminution du niveau des transcrits de PR-1). En tant que contrôle de l’expérience, l’expression de VAD1 a été déterminée par Q-RT-PCR (Figure 37B). Au cours de l’inoculation, les lignées surexpresseurs, comparées au parent sauvage Ws-4 et aux lignées témoins négatifs, présentent une augmentation de transcrits de VAD1 pour atteindre un maximum 48h après inoculation. Il est intéressant de noters que les lignées surexpresseurs exprimant le plus fortement VAD1 au cours du développement sont les lignées qui expriment le plus fortement VAD1 au cours de l’inoculation. Cependant, l’ensemble des données présentées ici sont préliminaires et devront être confirmées.

Les résultats présentés ici, bien que préliminaires, indiquent que la surexpression de VAD1 induit un retard dans l’apparition de la HR et dans l’accumulation de transcrits de gènes marqueurs de la HR, aussi bien au cours d’expériences d’expression transitoire ou par l’analyse de lignées transgéniques. Ces observations sont donc en accord avec l’hypothèse selon laquelle VAD1 serait un régulateur négatif de la mort cellulaire associée à la HR.

Logiciel Localisation prédite Site internet

Predotar Plastes http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html

ChloroP Chloroplastes (présence _{d’un peptide de transit )} http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/

Mitoprot Pas de localisation dans _{la mitochondrie} http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html

PTS1 Pas de localisation dans _{les péroxysomes} http://mendel.imp.univie.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/_{PTS1predictor.jsp}

WolfPSORT

Noyau

Réticulum endoplasmique Chloroplastes

http://wolfpsort.org/

TagetP Chloroplastes http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

Multiloc Cytoplasme _{tuebingen.de/Services/MultiLoc/index_html}http://www-bs.informatik.uni-

SLP-local Chloroplastes _{u.ac.jp/~smatsuda/slplocal.html}http://sunflower.kuicr.kyoto-

Tableau 4 : Tableau récapitulatif des différents sites et logiciels utilisés pour prédire la localisation subcellulaire de VAD1.