Au cours de cette partie de mon travail, nous nous sommes demandé si des molécules utilisées en thérapie anti-cancéreuse pouvaient réguler la vie et la mort des cellules cancéreuses via la régulation de l’expression de la protéine GABARAPδ1 et éventuellement de l’autophagie. Nous avons donc choisi de tester plusieurs composés susceptibles d’affecter la régulation et la fonction de la protéine GABARAPL1 :
- composés inhibiteurs du protéasome qui ont été décrits pour réguler l’expression de la protéine GABARAPL1 (MG132, Lactacystine et Bortezomib) (Seguin-Py et al., article soumis, voir publications annexes) ou de la protéine LC3 (MG132 et Bortezomib) mais également pour réguler le taux d’autophagie (Bortezomib et MG132) (Milani et al., 2009; Periyasamy-Thandavan et al., 2010) (Gao et al., 2010) ;
- composés anti-estrogéniques, tels que le 4OH-Tamoxifène ou le Raloxifène, décrits pour présenter un effet anti-prolifératif dans les cellules cancéreuses ER+ (Jordan & Brodie, 2007). D’autre part, il a été montré que le 4-OH régule également l’autophagie (Qadir et al., 2008) ;
141 - composés agissant sur la dépolymérisation des microtubules, tels que le Docetaxel, car nous savons que la protéine GABARAPL1 interagit avec la tubuline et que les microtubules sont essentielles pour le transport des autophagosomes et la fusion de ces vésicules avec les lysosomes (Mansuy et al., 2004; Webb et al., 2004).
1.1)-Effet du Bortezomib
Lors de nos expériences, nous avons voulu déterminer si le Bortezomib, en association avec des inhibiteurs de l’autophagie, régule l’expression de la protéine GABARAPδ1 de manière accrue par rapport au Bortezomib seul (Seguin-Py et al., 2011, article soumis, voir publications annexes) mais surtout, à plus long terme, si cette association de traitements induit la mort des cellules de cancer du sein en lien avec une régulation de l’expression de la protéine GABARAPL1.
Nous avons donc incubé des cellules MCF-7:FLAG-GABARAPL1-6HIS pendant 15 heures avec du Bortezomib (25 nM) en présence ou en absence d’inhibiteurs du flux autophagique : 3-Méthyladénine (10 mM) ou Bafilomycine A1 (500 nM). Les protéines totales ont ensuite été chargées sur un gel 15 % puis les protéines GABARAPL1, LC3, p62 et Actine ont été révélées par western-blotting grâce à des anticorps spécifiques.
Comme le montre la figure 23, en l’absence de stimulation, un seul signal d’un poids moléculaire de 19 kDa qui correspond à la protéine mature FLAG-GABARAPL1-I a été observé (piste 1). Dans ces mêmes cellules non stimulées, les deux formes de la protéine LC3 (I et II) ont été observées témoignant ainsi du niveau d’autophagie basale existant dans ces cellules. Nous observons également un faible taux de protéine p62 (piste 1).
Après inhibition de l’induction de l’autophagie par la γ-Méthyladénine (piste 2), nous observons une légère augmentation du taux des protéines FLAG-GABARAPL1-I, LC3-I et p6β. Par contre, nous observons l’apparition d’un signal migrant un peu plus vite que la protéine FLAG-GABARAPL1-I qui correspond à la protéine GABARAPL1-I endogène. Ces augmentations de niveaux de ces protéines sont probablement dues à une inhibition de la formation des autophagosomes et donc à une inhibition de la lipidation des protéines GABARAPδ1 et δCγ ainsi qu’une inhibition de leur dégradation, et de celle de p62, dans les lysosomes.
Lorsque les cellules sont traitées par la Bafilomycine A1 (piste 3), un inhibiteur de la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, nous observons une augmentation de la quantité de la forme -II de la protéine GABARAPL1 (migrant entre la protéine FLAG- GABARAPL1-I et la protéine endogène GABARAPL1-I). Pour LC3, nous observons
142 seulement une très légère différence avec l’échantillon contrôle mais cela peut être dû à la forte quantité de forme -II déjà présente dans les cellules non stimulées. Nous observons également une augmentation de la quantité de p6β qui n’est plus dégradée dans les lysosomes. Les niveaux de protéines FLAG-GABARAPL1-I, GABARAPL1-I endogène, LC3-I et
p62 sont également augmentés par le traitement au Bortezomib (piste 4). En revanche, nous n’observons pas de différence de niveaux de ces protéines lorsque les cellules sont traitées avec les deux composés associés, Bortezomib + 3-Méthyladénine ou Bafilomycine (pistes 5 et 6), par rapport aux niveaux observés dans les cellules traitées par ces drogues seules.
Ces résultats confirment que les niveaux des protéines FLAG-GABARAPL1-I et GABARAPL1-I sont régulés dans les cellules cancéreuses en réponse à des drogues utilisées en thérapie anti-cancéreuse (Bortezomib, 3-MA ou Bafilomycine A1). Des résultats semblables ont déjà été décrits pour la protéine LC3 avec le MG132 et le Bortezomib (Gao et al., 2010; Periyasamy-Thandavan et al., 2010). Cependant, l’association d’un composé inhibiteur du protéasome et d’un inhibiteur de l’autophagie ou de la voie lysosomale ne semble pas avoir d’effet synergique sur l’expression de GABARAPδ1. Cela peut être dû au
Figure 23 : Expression de GABARAPL1 en réponse au Bortezomib dans les cellules MCF-7:FLAG- GABARAPL1-6HIS. Les cellules ont été traitées avec 25 nM de Bortezomib, 500 nM BafA1, 10 mM de 3-
MA ou avec des combinaisons de Bortezomib + BafA1 ou 3-MA pendant 15 h. Les cellules ont ensuite été lysées et les extraits protéiques ont été chargés sur deux gels 15 %. La révélation du premier gel a été effectuée avec des anticorps dirigés contre les protéines GABARAPL1 et p62 (dilution 1/1000e) et la révélation du deuxième gel a été effectuée avec des anticorps dirigés contre les protéines LC3 et Actine (dilution 1/3000e).
143 fait que les niveaux d’expression sont importants et peuvent donc masquer des effets faibles mais significatifs.
Etant donné que l’autophagie protège les cellules cancéreuses contre la mort cellulaire induite par les conditions de stress induites par des composés chimiques utilisés en thérapie, il sera maintenant intéressant de déterminer si cette augmentation du taux de la protéine GABARAPδ1 régule le taux d’autophagie et protège les cellules de cancer du sein contre la mort cellulaire.
1.2)-Autres drogues
Nous avons également testé d’autres drogues chimiques utilisées en thérapie anti- cancéreuse et qui ciblent des voies cellulaires différentes de celle du protéasome. En ce qui concerne le Docetaxel, un agent inhibiteur de la dépolymérisation des microtubules, et les anti-estrogènes, 4OH-Tamoxifène et Raloxifène, nous n’avons pas observé d’effet sur l’expression de la protéine GABARAPδ1.