Des études précédentes effectuées au laboratoire ont montré que l’expression des ARNm gabarap et gabarapl1 est fortement diminuée dans différentes lignées de cellules cancéreuses (Nemos et al., 2003) :
- 2 lignées de lymphomes de Burkitt (Daudi et Raji) ;
- 3 lignées cellulaires issues de patients atteints de leucémies (HL-60, myéloblastique ; MOLT-4, lymphoblastique T et K-562, érythroblastique) ;
- 1 lignée de carcinome de poumon (A549) ; - 1 lignée d’adénocarcinome colorectal (SW480) ; - 1 lignée dérivée du cancer du col de l’utérus (HeLa).
Ces expériences ont été effectuées avec des sondes spécifiques dirigées contre les régions UTR-γ’ des ARNm car il n’existait pas, à cette époque, d’anticorps spécifique contre la protéine GABARAPL1.
Après avoir montré que l’anticorps ProteinTech (PTG-FL, 11010-1-AP) différenciait les deux protéines in vitro et in vivo, nous avons mené une étude plus large de l’expression de la protéine GABARAPL1 dans différentes lignées cellulaires cancéreuses, immortalisées ou primaires. Nous avons également étudié l’expression de deux homologues de GABARAPδ1, les protéines GABARAP et δCγB et un marqueur de l’activité autophagique, la protéine p62. Les lignées suivantes ont été étudiées :
- 3 lignées dérivées de cancer du sein (MCF-7, MDA-MB231, MDA-MB436) ; - 1 lignée dérivée de cancer du col de l’utérus (Heδa) ;
- 3 lignées dérivées de patients atteints de leucémies (HL60, myéloblastique ; U937, monocytaire ; et NB4, promyélocytaire) ;
- 1 lignée dérivée de neuroblastome (SKN-BE) ;
- 1 lignée de rat dérivée de phéochromocytome (PC12) ;
- 4 lignées immortalisées par l’antigène grand T du SV40 (fibroblastes de souris MEF ; cellules d’endomètre de cobaye S1A5 ; cellules rénales de singe COS7 ; fibroblastes de poumon humain MRC-5) ;
- 1 lignée immortalisée par l’adénovirus 5 (cellules embryonnaires de rein humaines HEK293) ;
128 Des lysats protéiques des différentes lignées ont été préparés puis l’expression de GABARAPL1 a été étudiée par western-blotting grâce à l’anticorps spécifique de la protéine GABARAPL1 (11010-1-AP, ProteinTech). La protéine GABARAP, quant à elle, a été
révélée en même temps que GABARAPL1, par l’anticorps non spécifique anti-GABARAPL1
obtenu chez Chemicon (Chakrama et al., 2010).
Comme le montre la figure 18, dans les lignées cellulaires non cancéreuses (MRC-5, HEK293, COS7, MEF, S1A5 et MEF primaire, pistes 10 à 15), un niveau basal d’expression
Figure 18: Expression de la protéine GABARAPL1 dans différentes lignées cellulaires. 50 µg de protéines
totales ont été chargées sur un gel 15 %. La révélation a été effectuée avec des anticorps dirigés contre les protéines GABARAPL1 (Protein Tech, 1/1000e ; Chemicon, 2000e), Actine (1/3000e), LC3 (1/3000e), p62 (1/1000e) et le kit de bioluminescence ECL Plus. C : Extrait protéique de cerveau de rat.
129 de GABARAPL1 est détecté avec une expression plus élevée dans les cellules MEF immortalisées et MRC-5.
Dans les lignées cellulaires cancéreuses (pistes 1 à 9), l’expression de la protéine GABARAPL1 est variable. Ainsi, elle est indétectable dans les cellules U937, SKNBE et MCF-7 (pistes 4, 5 et 7) et très faiblement exprimée dans les cellules HL60, NB4 et MDA- MB231 (pistes 2, 3 et 9). Un niveau moyen d’expression, comparable à celui observé dans les cellules normales HEK293 et COS7 (pistes 11 et 12), a été détecté dans les lignées cancéreuses PC12 et MDA-MB436 (pistes 6 et 8). Par contre, la plus forte expression de GABARAPL1 endogène, comparable à celle observée dans le cerveau de rat, a été observée dans la lignée HeLa (piste 1).
δ’utilisation de l’anticorps anti-GABARAPL1 (Chemicon) non spécifique a permis de détecter deux signaux : le premier migrant à une taille de 17 kDa correspond à la protéine GABARAPL1 et le second migrant plus loin correspond à la protéine GABARAP. Nous avons alors observé que dans les cellules non cancéreuses (pistes 10 à 15), GABARAP est exprimée à des niveaux à peu près équivalents dans toutes les lignées sauf dans les cellules S1A5 (piste 14) où elle est indétectable. Dans les lignées cancéreuses (pistes 1 à 9), GABARAP est détectée dans toutes les lignées et présente des taux d’expression importants, particulièrement dans les lignées HeLa HL60, NB4, U937 et MCF-7 (pistes 1, 2, 3, 4 et 7). Par ailleurs, l’utilisation de cet anticorps permet également de détecter la protéine GABARAPL1. En effet, une bande de taille supérieure à celle de GABARAP est observée dans les cellules HeLa, MRC-5 et MEF immortalisées (pistes 1, 10 et 13), les trois lignées qui présentent un signal GABARAPδ1 important avec l’anticorps spécifique. Il est à noter que dans l’extrait de cerveau de rat, une seule bande correspondant à GABARAPδ1 est détectée, démontrant une plus forte expression de GABARAPL1 par rapport à GABARAP dans cet organe. Cela confirme les données obtenues lors de l’étude effectuée sur l’expression des ARNm (Mansuy-Schlick et al., 2006b).
En ce qui concerne l’expression de la protéine δCγ, deux signaux ont été observés : le premier de 19 kDa environ correspond à la forme mature de LC3 (LC3-I) et le second correspond à la forme modifiée de LC3 (LC3-II). Dans les cellules non cancéreuses (pistes 10 à 15), LC3 est très faiblement exprimée dans les cellules HEK293, S1A5 et MEF en culture primaire (pistes 11, 14 et 15). Des taux plus importants sont observés dans les cellules MRC- 5, COS7 et MEF immortalisées (pistes 10, 12 et 13) avec apparition de la forme LC3-II dans les lignées MRC-5 et COS7 (pistes 10 et 12). Dans les lignées cancéreuses (pistes 1 à 9), la protéine LC3 est faiblement exprimée dans la plupart des lignées mais présente une forte
130 expression dans les lignées SKNBE et PC12 (pistes 5 et 6). Par ailleurs, la forme II de LC3 est observée uniquement dans les lignées MDA-MB436 et MDA-MB231 (pistes 8 et 9).
δ’activité autophagique a été étudiée dans toutes ces lignées grâce à la détection de la protéine p62. En effet, il a été décrit que la protéine p62 est dégradée par autophagie donc toute augmentation du flux autophagique, caractérisée par une augmentation du nombre d’autophagosomes et donc de la forme -II de LC3, devrait conduire à une diminution des niveaux de p62 dans les cellules. Il a été également décrit dans la littérature que p62 est fortement exprimée dans de des tissus tumoraux, ce qui est en corrélation avec une inhibition de l’autophagie (Zatloukal et al., 2007). D’après la figure 18, la protéine p62 est fortement exprimée dans les lignées de cancer du sein MDA-MB436 et MDA-MB231 (pistes 8 et 9) et plus faiblement exprimée dans les cellules HeLa (piste 1). Dans les cellules non cancéreuses, p62 est seulement détectée dans les lignées MRC-5 et COS7 (pistes 10 et 12). Il est à noter que l’on détecte également une augmentation de la forme -II de la protéine LC3 dans les lignées MDA-MB436, MDA-MB231, MRC-5 et COS7 (pistes 8, 9, 10 et 12). Seule la lignée HeLa (piste 1) présente un taux élevé de p62 mais une absence totale de LC3-I ou LC3-II. Ces données sont donc en contradiction avec l’hypothèse émise mais pourraient être expliquées par un blocage de la fusion des autophagosomes avec les lysosomes et donc une inhibition de la dégradation de LC3-II et p62.
Ces résultats, obtenus sur un nombre restreint de lignées cellulaires, ne nous ont pas permis de dégager un profil d’expression de GABARAPδ1 qui puisse être associé à un groupe de lignées cellulaires provenant d’un même organe. Cependant, ces données, obtenues pour la première fois sur la protéine, confirment celles obtenues sur l’expression des ARNm. En effet, nous avons observé une faible expression de cette protéine dans la plupart des lignées cancéreuses (excepté pour les cellules Heδa), comparativement à l’expression dans le cerveau de rat.
Notre étude montre surtout qu’il existe des différences d’expression entre les protéines GABARAPL1, GABARAP et LC3 qui appartiennent à la même famille Atg8. En effet, une variation d’expression de GABARAPδ1 et δCγ, mais pas de GABARAP, est observée dans toutes ces lignées. De plus, les protéines GABARAPL1 et LC3 présentent un profil d’expression relativement proche pour plusieurs lignées. Par exemple, un niveau d’expression faible voir inexistant des protéines GABARAPL1 et LC3 est observé dans les cellules cancéreuses dérivées de patients atteints de leucémies (HL60, NB4, et U937) alors que la protéine GABARAP est fortement exprimée dans ces cellules. Ces résultats nous permettent
131 de conclure sur un profil d’expression différent de ces protéines de la même famille et en particulier sur de fortes différences entre les deux homologues, GABARAP et GABARAPL1.