Les souris knockout GABARAP-/- nous ont été fournies par le Pr. Heinrich Betz (Max- Planck Institute for Brain Research, Allemagne). Elles ont été créées à partir de cellules souches embryonnaires dans lesquelles le gène gabarap a été inactivé par la technique du gene trap. Ces souris ont été produites afin d’étudier l’effet de l’inhibition de l’expression de la protéine GABARAP sur son rôle dans le transport du récepteurs GABAA (O'Sullivan et al.,
150 phénotype les distinguant des souris sauvages. En plus de l’absence de phénotype particulier, le niveau d’expression et la localisation de la sous-unité β du récepteur GABAA ne sont pas
affectés par l’inhibition de la protéine GABARAP. Ces résultats suggèrent que la protéine GABARAP n’est pas essentielle au transport du récepteur GABAA à la membrane plasmique
ou qu’elle n’est pas la seule impliquée dans ce transport. Etant donné la forte homologie entre les protéines GABARAP et GABARAPL1, ainsi que la forte expression de GABARAPL1 dans le système nerveux central et son rôle dans le transport du récepteur GABAA, il est
fortement probable que la protéine GABARAPL1 se substitue à GABARAP et exerce cette fonction. Ainsi, ces résultats suggèrent que ces deux protéines peuvent être redondantes pour leur rôle dans le transport du récepteur GABAA.
Comme décrit auparavant, l’étude de GABARAPδ1 est rendue très difficile in vivo et dans les cellules du fait de la forte homologie des protéines de la sous-famille GABARAP. Nous avons donc décidé d’établir une lignée immortalisée MEF:GABARAP-/- afin d’étudier le rôle de la protéine GABARAPL1 endogène dans un contexte biologique en absence de son homologue le plus proche, GABARAP. Cela apparaît d’autant plus nécessaire que les expériences que j’ai effectuées au laboratoire avec des shRNA ont démontré la difficulté d’inhiber l’expression d’une protéine sans altérer celle de son homologue, même en ciblant les ARNm. Nous pourrons ainsi étudier le rôle de GABARAPL1 dans différents processus biologiques et donc conclure sur la redondance éventuelle de ces deux protéines homologues.
Les fibroblastes embryonnaires MEF:GABARAP-/- ont été isolés à partir des souris knockout pour le gène gabarap. Brièvement, 15 embryons ont été récupérés à J14 puis incubés dans une solution de trypsine 0,02 % pendant la nuit. Les embryons ont ensuite été homogénéisés dans du milieu DMEM complet supplémenté de 10 % de SVF puis les cellules ont été mises en culture en plaques de 10 cm de diamètre. Ces cellules ont été cultivées pendant cinq passages avant que nous n’observions une diminution de leur prolifération. Nous avons alors débuté deux protocoles d’immortalisation : un protocole d’immortalisation spontanée et un protocole basé sur l’expression de l’antigène grand T du virus SV40.
2.1)-Culture primaire
Après isolement et culture des MEF:GABARAP-/- primaires à partir d’embryons de souris, nous avons effectué un génotypage de ces cellules afin de confirmer leur caractère homozygote et leur phénotype. Nous avons donc effectué une réaction PCR à partir d’ADN génomiques extraits de cellules MEF:WT (Wild Type) immortalisées et de cellules MEF:GABARAP-/- maintenues en culture primaire et d’amorces ciblant le gène gabarap.
151 D’après la figure β7, un signal de 1500 pb correspondant à l’amplification du gène gabarap a été observé dans les cellules MEF:WT mais pas dans les cellules MEF:GABARAP-/-. Ce résultat démontre que le gène gabarap n’est pas présent dans les cellules MEF:GABARAP-/- confirmant ainsi le phénotype de ces cellules. Nous avons également effectué des réactions PCR qui permettent à la fois l’amplification du gène gabarap et de la séquence nucléotidique ayant été inséré à l’intérieur du gène pour inhiber son expression. Les résultats obtenus, non décrits ici, confirment ceux obtenus lors du génotypage des souris MEF:GABARAP-/- avec les amorces spécifiques de gabarap (O'Sullivan et al., 2005).
Nous avons ensuite vérifié l’extinction de l’expression du gène gabarap et de la synthèse de la protéine par western-blotting. Pour cela, les protéines totales (40 µg) de cellules MEF:GABARAP-/- ou MEF:WT, au même stade de culture (1, 2 ou 3 passages), ont été chargées sur un gel SDS-PAGE 15 %. La détection des protéines GABARAP et GABARAPL1 a été réalisée grâce à deux anticorps anti-GABARAPL1 différents. Le premier de ProteinTech est spécifique de GABARAPL1 alors que le deuxième de Chemicon reconnait les deux homologues (figure 28).
δorsque nous utilisons l’anticorps non spécifique, nous observons un seul signal pour les cellules MEF:WT de passage 1 et ce signal correspond à GABARAP (piste 1). Dans les
Figure 27 : Génotypage des cellules MEF:GABARAP-/-. δ’ADN génomique a été extrait à partir des
cellules MEF:WT et MEF:GABARAP-/- puis une PCR ciblant le gène gabarap a été effectuée avec les amorces et selon les conditions décrites dans les travaux de O’Sullivan (O'Sullivan et al., 2005). Les produits de PCR ont été chargés sur un gel d’agarose 1 % puis révélés à l’aide du BET. PM : Marqueur de poids moléculaire 1kb ladder plus (Fermentas).
152 cellules MEF:GABARAP-/-, nous observons également un seul signal de taille légèrement supérieure qui correspond à GABARAPL1 (piste 2).
Pour les passages β et γ, nous obtenons les mêmes résultats si ce n’est que nous visualisons maintenant les deux protéines avec l’anticorps non spécifique confirmant que ces deux signaux correspondent bien à GABARAPL1 et GABARAP (pistes 3/4 et 5/6).
Il faut souligner que le taux de GABARAPL1 est accru dans les cellules MEF:GABARAP-/- par rapport aux cellules sauvages (passage 1, pistes 1 et 2) mais semble diminuer au fil des passages suivants (comparer les pistes 2, 4 et 6). Au contraire, dans les cellules sauvages, alors que l’expression de GABARAPδ1 n’est pas détectée dans le passage 1 (piste 1), elle apparaît aux passages suivants (pistes 3 et 5).
Ces résultats suggèrent que l’expression de GABARAPδ1 est régulée au cours de l’évolution des cultures primaires de fibroblastes embryonnaires de souris et que cette expression est fortement induite dans les cellules primaires qui n’expriment plus la protéine
Figure 28 : Expression de GABARAPL1 au cours des différents passages de cultures primaires de cellules MEF:WT et MEF:GABARAP-/-. Les protéines totales (40 µg), extraites de cellules primaires à
différents passages, ont été chargées sur un gel SDS-PAGE 15 %. La révélation a été effectuée avec deux anticorps dirigés contre la protéine GABARAPL1 (dilution 1/1000e) et un anticorps dirigé contre l’Actine (dilution 1/3000e).
153 GABARAP. Ces résultats n’avaient pas été décrits par O’Sullivan et collaborateurs qui avaient conclu que l’expression des protéines GABARAPδ1 et GABARAPδβ n’était pas altérée dans les souris gabarap KO (O'Sullivan et al., 2005).
2.2)-Immortalisation des cellules primaires MEF:GABARAP-/-
Lors de la culture des cellules primaires MEF:GABARAP-/-, nous avons observé une diminution de la prolifération significative après les cinq premiers passages. Afin de les maintenir en culture pour une durée indéterminée, nous avons choisi d’immortaliser les cellules MEF:GABARAP-/- et pour cela deux protocoles d’immortalisation différents ont été utilisés : l’immortalisation spontanée et l’immortalisation par l’antigène grand T du virus SV40 (Figure 29).
δ’immortalisation spontanée consiste en une série de passages des cellules jusqu’à restauration de leur capacité à proliférer. Deux critères sont requis pour l’immortalisation spontanée : l’apparition de mutations activant des oncogènes et les rendant constitutivement actifs et l’activation de l’activité télomérasique, importante pour le maintien de la longueur des télomères au cours des divisions. Pour ce protocole, 30 flasques de 25 cm2 contenant 300 000 cellules ont été mises en cultures puis des sous-cultures ont été réalisées tous les trois jours avec la même densité cellulaire. Après 27 passages, nous avons isolé 60 clones à partir des deux boîtes encore en culture. A ce stade, seulement la moitié des clones ont survécu et à partir du stade 33, la quasi-totalité des clones sont morts. Deux semaines plus tard, des cellules ont proliféré et ont formé de nouveaux clones qui ont été récolté et remis en culture.
δ’immortalisation par l’antigène grand T du virus SV40 a consisté en la transfection des cellules MEF:GABARAP-/- par un vecteur d’expression de l’antigène grand T du virus SV40. δ’antigène T a la capacité de d’inhiber les protéines Rb et p53 ce qui l’entrée en phase S des cellules surexprimant l’antigène T. Ces cellules présentent donc une durée de vie plus importante que les cellules primaires. Au laboratoire, une lignée d’endomètre de cobaye immortalisée a déjà été établie (Nemos et al., 2004) et nous avons donc utilisé le même protocole d’immortalisation. δes cellules ont été transfectées par le vecteur d’expression du grand T de SV40 puis les clones résistants ont été repris et cultivés. A partir du passage 20, les cellules ont atteint une phase de crise qui est décrite comme une crise cellulaire qui est associée à la réactivation de la télomérase. Seules les cellules qui échappent à cette crise sont considérées comme immortalisées. Actuellement, nos clones ont dépassé la crise et sont en culture dans l’attente de la prolifération de cellules résistantes qui seront ensuite considérées comme immortalisées.
154 A la suite de ces deux protocoles, nous avons analysé l’expression de la protéine GABARAPL1 dans les cellules MEF:GABARAP-/- immortalisées spontanément et dans les cellules MEF:GABARAP-/-en cours d’immortalisation par l’antigène grand T du virus SV40. Nous avons utilisé comme contrôles positifs de l’immortalisation par l’antigène grand T, les cellules MEF:WT et MEF:Atg5-/-. Pour cela, 40 µg de protéines totales extraites à partir de cellules MEF:WT immortalisées, MEF:Atg5-/- immortalisées, MEF:GABARAP-/- primaires, MEF:GABARAP-/- immortalisées spontanément et MEF:GABARAP-/- immortalisées par le grand T de SV40 ont été chargés sur un gel 15 %. La détection des protéines GABARAPL1 et grand T de SV40 a été effectuée grâce à des anticorps spécifiques (Figure 30).
Comme le montre la figure 30, la protéine GABARAPL1 est exprimée à un niveau
comparable dans les cellules MEF:GABARAP-/- immortalisées spontanément,
155 MEF:GABARAP-/- primaires (stade 4), MEF:Atg5-/- immortaliséeset MEF:WT immortalisées (pistes 6 à 9). Par contre, la protéine GABARAPL1 est plus faiblement exprimée dans les 3 clones en cours d’immortalisation par le grand T de SV40 (pistes 3 à 5). Par ailleurs, nous avons bien confirmé l’expression de l’antigène grand T de SV40 dans les cellules MEF:WT, MEF:Atg5-/- et dans les clones 22, 26 et 32 (pistes 2, 3, 4, 8 et 9). Ce résultat démontre pour la première fois que l’expression de la protéine GABARAPL1 est régulée négativement dans les cellules transfectées par le grand T de SV40. Il sera donc intéressant d’étudier l’expression de GABARAPL1 dans les mêmes cellules après leur immortalisation afin de déterminer si l’expression de GABARAPδ1 varie au cours des stades d’immortalisation par l’antigène grand T de SV40 dans les cellules n’exprimant pas la protéine GABARAP par rapport aux cellules immortalisées sauvages (MEF:WT).
Figure 30 : Expression de GABARAPL1 dans les cellules MEF:GABARAP-/- primaires, immortalisées spontanément et en cours d’immortalisation par le grand T de SV40. Les protéines totales (40 µg)
extraites de cellules MEF:WT, MEF:Atg5-/-, MEF:GABARAP-/- primaires, immortalisées spontanément et en cours d’immortalisation par le grand T de SV40 ont été chargées sur un gel SDS-PAGE 15 %. La révélation a été effectuée avec les anticorps dirigés contre les protéines GABARAPL1 (dilution 1/1000e), Actine (dilution 1/3000e) et antigène grand T (1/2000e) et le kit de bioluminescence ECL Plus.
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3)-Etablissement des lignées MCF-7 et HEK293:DsRed-GABARAPL1
Au cours de ce travail, j’ai établi deux lignées cellulaires HEK293 et MCF-7 qui surexpriment la protéine de fusion DsRed-GABARAPL1. Ces deux lignées ont été utilisées pour l’étude de la localisation intracellulaire de la protéine GABARAPL1. Ces expériences ont montré que GABARAPL1 est localisée dans des vésicules intracellulaires marquées avec un colorant des lysosomes, le Lysotracker green. De plus, des expériences de transfection transitoire de cellules HEK et MCF-7:DsRed-GABARAPL1 par un vecteur codant la protéine GFP-LC3 ont montré que les deux protéines DsRed-GABARAPL1 et GFP-LC3 co-localisent dans des vésicules intracytoplasmiques après inhibition du flux autophagique (Chakrama et al., 2010).
D’autre part, cette lignée a été utilisée pour un autre projet, initié et effectué au laboratoire par Stéphanie Seguin-Py au cours de sa thèse, qui consistait en la recherche de nouveaux partenaires de GABARAPL1. Les résultats obtenus ont montré, par GST-pull down couplée à la spectrométrie de masse, que GABARAPL1 interagit avec la protéine HSP90 (Heat Shock Protein 90β). Cette interaction a ensuite été confirmée par des expériences de co- immunoprécipitation et de co-localisation in vitro et in vivo. Il a également été montré que HSP90α/ est une protéine chaperonne de la protéine GABARAPL1 et que l’inhibition de l’interaction de ces deux protéines induit la dégradation de GABARAPL1 par le protéasome.
La lignée MCF-7:DsRed-GABARAPδ1 que j’ai créée a été utilisée pour l’étude de la co-localisation intracellulaire de GABARAPL1 avec son nouveau partenaire HSP90α/ .
Les résultats de cette étude sont présentés dans la publication suivante placée en annexe :
« Identification of HSP90α/β as a new GABARAPL1 (GEC1)-interacting protein »
Stéphanie Seguin-Py, Géraldine Lucchi, Sophie Croizier, Fatima Z. Chakrama, Gilles Despouy, Jaclyn N. Le Grand, Patrick Ducoroy, Wilfrid Boireau, Michaël Boyer-Guittaut, Michèle Jouvenot, Annick Fraichard, Régis Delage-Mourroux.
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