Biologie moléculaire

1)-Vecteurs

Tous les vecteurs utilisés au cours de ce travail sont répertoriés dans le tableau 3.

1.1)-Vecteurs commerciaux

Les vecteurs commerciaux pEGFP-C1 et pEGFP-N3 (Clontech, 6084-1 et 6080-1) comportent un site de multi-clonage en amont ou en aval de l’ADNc de la GFP (Green Fluorescent Protein) respectivement, une origine de réplication, un gène de résistance à la néomycine et à son analogue G418, et un gène de résistance à la kanamycine. Ces vecteurs ont été utilisés pour cloner les ADNc gabarap et gabarabl1 en phase avec la séquence codant la GFP afin d’obtenir les vecteurs recombinants pGFP-GABARAP, pGABARAP-GFP, pGFP-GABARAPL1 et pGABARAPL1-GFP. Les vecteurs pGABARAPL1-GFP et pGABARAP-GFP obtenus ont ensuite été utilisés pour construire, par mutagenèse dirigée, les vecteurs pGABARAPL1-G116A-GFP et pGABARAP-G116A-GFP, respectivement.

Le plasmide pOG44 (Invitrogen, V6005-20) code la Flp recombinase issue de Saccharomyces cerevisiae. Il comporte également un gène de résistance à l’ampicilline. Ce vecteur a été utilisé lors de la création des lignées cellulaires stables HEK293:FLAG- GABARAPL1-6his et HEK293:FLAG-GABARAPL1-G116A-6his à partir de la lignée parentale Flp-in-HEK293 (Invitrogen, R75007).

Toutes les cartes des vecteurs commerciaux utilisés sont fournies en annexe.

1.2)-Vecteurs disponibles au laboratoire ou obtenus d’autres laboratoire

Les vecteurs pGFP-LC3, pDsRed-LC3 et pSF1-Flag(3X):hsAtg4B:Myc:6his, ont été obtenus auprès des laboratoires du Dr. Zvunlun Elazar (Weizmann Institute, Israël), du Dr. Iovanna (Marseille, France) et du Dr. Yoshimori (Osaka University, Japon), respectivement.

Le vecteur pGEX4T2-GABARAP codant la protéine de fusion GST-GABARAP a été gracieusement fourni par le Dr. Olsen (University of California, USA).

Les vecteurs pGFP-GABARAPL1, pGABARAPL1-GFP et pDsRed-GABARAPL1 ont été précédemment obtenus au sein de notre laboratoire. Ces vecteurs expriment les protéines GFP-GABARAPL1, GABARAPL1-GFP et DsRed-GABARAPL1 et portent des gènes de résistance à la kanamycine (pGFP) ou l’ampicilline (pDsRed). Ils comportent également un gène de résistance au G418. Le vecteur ps701ts-ori-SV40gT, généreusement

88 fourni par le Dr. Feunten (Institut Gustave Roussy, Paris), exprime l’antigène grand T du virus SV40. Ce vecteur a été utilisé pour établir la lignée immortalisée MEF:GABARAP-/-.

Le vecteur pCDNA5.1/FRT:FLAG-GABARAPL1-G116A-6his a été obtenu par mutagenèse dirigée à partir du vecteur pCDNA5.1/FRT:FLAG-GABARAPL1-6his, disponible au laboratoire. Ce vecteur comporte les gènes de résistance à l’ampicilline et à l’hygromycine. Il a été utilisé pour créer la lignée stable HEK293 surexprimant la protéine mutante FLAG-GABARAPL1-G116A-6his.

Plasmides Provenance Protéine exprimée Antibiotiques de sélection

pEGFP-C1 Clontech GFP Kanamycine/G418

pEGFP-N3 Clontech GFP Kanamycine/G418

pGFP-GABARAPL1 Construit au

laboratoire GFP-GABARAPL1 Kanamycine/G418 pGABARAPL1-GFP Fourni GABARAPL1-GFP Kanamycine/G418

pOG44 Invitrogen Flp recombinase Ampicilline

pGFP-LC3 Fourni GFP-LC3 Kanamycine/G418

pSF1-

Flag(3X):hsAtg4B:Myc:6HIS Fourni Flag(3X):hsAtg4B:Myc:6his Ampicilline

pDsRed-LC3 Fourni DsRed-LC3 Ampicilline/G418

pGEX4T2-GABARAP Fourni GST-GABARAP Ampicilline

pDsRed-GABARAPL1 Disponible au

laboratoire DsRed-GABARAPL1 Ampicilline/G418 ps701ts-ori-SV40gT Fourni Protéine grand T du SV40 Ampicilline/Zéocine pcDNA5.1/FRT:FLAG- GABARAPL1-G116A-6HIS Disponible au laboratoire FLAG-GABARAPL1- G116A-6HIS Ampicilline/Hygromicyne pcDNA3.1:FLAG- GABARAPL1-6HIS Disponible au

laboratoire FLAG-GABARAPL1-6HIS Ampicilline/Hygromicyne pGABARAP-GFP Construit au cours

de ce travail GABARAP-GFP Kanamycine/G418 pGFP-GABARAP Construit au cours

de ce travail GFP-GABARAP Kanamycine/G418 pGABARAPL1-G116A-GFP Construit au cours

de ce travail GABARAPL1-G116A-GFP Kanamycine/G418 pGABARAP-G116A-GFP Construit au cours

de ce travail GABARAP-G116A-GFP Kanamycine/G418

89 Le vecteur pcDNA3.1:FLAG-GABARAPL1-6HIS a été construit au laboratoire. Ce vecteur comporte les gènes de résistance à l’ampicilline et à l’hygromycine. Il a été utilisé pour créer la lignée stable MDA-MB231 surexprimant la protéine FLAG-GABARAPL1- 6HIS.

1-3)-Vecteurs construits pour ce travail de thèse pGABARAP-GFP et pGFP-GABARAP

Ces vecteurs codent les protéines de fusion GFP dans lesquelles la protéine GABARAP a été placée en amont ou en aval de la GFP. Pour construire ces différents vecteurs, l’ADNc de gabarap a été amplifié par PCR à partir du vecteur pGEX4T2- GABARAP. Les amorces spécifiques comportant des sites de restriction définis sont décrites dans le tableau 4. Les fragments PCR ont ensuite été digérés par les enzymes de restriction citées dans le tableau puis clonés en phase avec la séquence du gène de la GFP dans les vecteurs pEGFP-C1 et pEGFP-N3. Les vecteurs recombinants ont ensuite été vérifiés par séquençage (Applied Biosystems, Genetic Analyzer 3130).

pGABARAPL1-G116A-GFP et pGABARAP-G116A-GFP

Les vecteurs pGABARAPL1-G116A-GFP et pGABARAP-G116A-GFP ont été obtenus par mutagenèse dirigée à partir des vecteurs pGABARAPL1-GFP et pGABARAP- GFP, respectivement selon le protocole décrit ci-après.

2)-Protocoles

2.1)-Amplification d’ADN par PCR

Les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume final de 25 µL de tampon de réaction contenant 200 µM de dNTP, 0,2 µM de chaque amorce, 1,5 mM de MgCl2, 15 ng de

matrice ADN et 1 U de GoTaq polymérase (Promega, M8305). Les mélanges réactionnels ont ensuite été placés dans un thermocycleur (Applied Biosystems, GeneAmp PCR System 9700). Le programme utilisé pour l’amplification de l’ADNc gabarap comprend une étape de β min à 9β°C puis γ0 cycles composés d’une étape de dénaturation pendant γ0 s à 9β°C, d’une étape d’hybridation pendant γ0 s à 55°C et d’une étape d’élongation pendant 1 min et 30 s à 72°C.

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2.2)-Electrophorèse sur gel d’agarose

Après dilution dans un tampon de charge 1X (3 mM Bleu de bromophénol, 1.5 M Saccharose, 10 mM Tris-HCl pH 8) et chargement sur un gel d’agarose 1 %, les fragments PCR ont migré à 50 V pendant 40 min dans un tampon TAE (40 mM Tris-acétate pH 8, 1 mM EDTA). δ'ADN a été révélé par un bain de 15 min dans une solution de bromure d’éthidium (BET) (0,5 µg/ml). Le marqueur de taille utilisé est le 1 kb DNA Ladder Plus (Invitrogen, 10787018).

2.3)-Clonage des fragments PCR

Les fragments PCR ou les vecteurs plasmidiques ont été incubés pendant 2 h à 37°C avec 1 unité d’enzyme par microgramme d'ADN dans le tampon indiqué par le fournisseur (Fermentas). Après séparation des produits de digestion par électrophorèse selon le protocole décrit précédemment, les fragments correspondant aux vecteurs et aux inserts digérés ont été découpés et purifiés avec le Kit Nucleospin Extract II (Macherey-Nagel, 740609) selon les recommandations du fournisseur. Les ligatures des fragments PCR et des vecteurs pEGFP-C1 et pEGFP-N1 digérés ont été effectuées pendant 1 nuit à 4°C en présence de 50 ng de vecteur, 150 ng du produit de PCR et 1 unité de T4 ADN ligase (Fermentas, EL0011) dans le tampon

de réaction recommandé par le fournisseur (Fermentas).

2.4)-Transformation des bactéries compétentes

Les bactéries E. coli compétentes (50 µl de JM109) ont été incubées pendant 30 min sur glace avec 10 à 100 ng d'ADN de la réaction de ligature. Un choc thermique à 42°C a été réalisé pendant 1 min puis les bactéries ont été replacées sur glace pendant 2 min. Les bactéries ont ensuite été incubées pendant 2 heures à 37°C dans 950 µl de milieu Luria Bertani [1% (p/v) Tryptone, 0,5% (p/v) extrait de levure, 1% (p/v) NaCl] puis étalées sur milieu sélectif gélosé composé de LB-Agar (15 g/l) contenant de la kanamycine (50 µg/ml) ou de l’ampicilline (100 µg/ml). Après 24 h à 37°C, les colonies bactériennes ont été ensemencées dans γ ml de milieu δB pendant β4 h à γ7°C puis l’ADN plasmidique a été purifié par le protocole de lyse alcaline décrit ci-dessous.

2.5)-Mini-préparation d’ADN plasmidique

Après centrifugation, le culot bactérien a été repris dans 100 µl d’une solution I (50 mM glucose, 25 mM Tris-Hcl pH 8, 10 mM EDTA) puis dans 200 µl de la solution II (0,2 N NaOH , 1% SDS) et 150 µl d’une solution III (5ε acétate de sodium,11.5 % acide acétique

91 glacial). δ’ADN plasmidique a ensuite été purifié par extraction phénolique, lavé et précipité à l’éthanol puis repris dans 50 µl d’eau ultrapure.

2.6)-Séquençage

Le séquençage des ADN plasmidiques a été réalisé par Fabrice Poncet (Plateforme séquençage, IFR133) selon la méthode de Sanger (Sanger et al., 1977) au moyen d’un séquenceur automatique (Applied Biosystems, Genetic Analyser 3130).

2.7)-Maxi-préparation d’ADN plasmidique

La purification des plasmides a été effectuée à partir de 200 ml de culture bactérienne d’une nuit à γ7°C et sous agitation. δ’extraction a été effectuée avec le kit εaxi-HiSpeed (Quiagen, 12662) selon les recommandations du fournisseur.