Au cours de mon travail, j’ai montré que GABARAPδ1 est associée au processus autophagique mais des données précédentes obtenues au laboratoire ont également montré que la surexpression de GABARAPL1 dans les cellules HEK293 active leur prolifération (Seguin-Py, 2007). Cependant, aucune donnée ne nous a encore permis de conclure à un lien éventuel entre GABARAPL1, son implication au cours de l’autophagie et une augmentation de la prolifération cellulaire.
Pour répondre à cette question, nous avons donc établi une lignée cellulaire stable HEK293 dans laquelle la protéine GABARAPL1 mutée au niveau de la glycine 116 est surexprimée. Le résidu glycine de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS a été remplacé par une alanine pour donner la protéine FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS. Nous avons montré précédemment, par transfection transitoire du vecteur pGABARAPL1-G116A-GFP dans les cellules HEK293, que cette mutation inhibe la maturation de la protéine GABARAPL1 (Chakrama et al., 2010). Il a également été montré que cette mutation inhibe la liaison aux phospholipides, et donc aux autophagosomes, des protéines LC3 et GABARAP (Tanida et al., 2004b; Tanida et al., 2004c).
Dans un premier temps, nous avons voulu valider notre modèle et confirmer que la protéine mutée n’est pas liée à des phospholipides dans cette lignée cellulaire stable (Figure 26). Pour cela, nous avons incubé les cellules HEK293, HEK293:FLAG-GABARAPL1-6HIS
et HEK293:FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS en présence de NH4Cl (2 h) ou Bafilomycine
A1 (16 h), des inhibiteurs du flux autophagique qui induisent l’accumulation des formes liées aux phospholipides (-II) des protéines de la famille Atg8. Nous avons ensuite chargé les protéines totales sur un gel SDS-PAGE 15 % puis révélé les protéines GABARAPL1 et Actine par western-blotting. Pour la révélation de GABARAPL1, nous avons utilisé un anticorps non spécifique (Chemicon) qui reconnaît également GABARAP.
Comme le montre la figure 26, dans les cellules non induites HEK293 (piste 1), nous observons un seul signal à 15 kDa environ qui correspond à la protéine GABARAP-I. En effet, nous avons montré que dans ces cellules la protéine endogène GABARAPδ1 n’est pas détectée avec cet anticorps (Chakrama et al., 2010).
148 Dans les cellules non induites HEK293:FLAG-GABARAPL1-6HIS (piste 4), deux signaux sont observés. Le premier signal d’une taille de 19 kDa (*) correspond à la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS surexprimée et le deuxième migrant plus loin correspond à la protéine GABARAP. Ces protéines sont probablement les protéines matures, clivées au niveau de leur glycine 116, puisqu’il a été montré que ces protéines sont clivées dès leur synthèse dans les cellules (Chakrama et al., 2010). Nous observons donc les protéines FLAG- GABARAPL1-I et GABARAP-I.
Dans les cellules non induites HEK293:FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS (piste 7), deux signaux sont observés. δe premier signal d’une taille de 19 kDa (*, piste 4) correspond à la protéine FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS surexprimée et le deuxième migrant plus loin correspond à la protéine GABARAP-I.
En revanche, lorsque les cellules ont été incubées avec les inhibiteurs du flux autophagique, nous avons observé des différences dans l’accumulation des formes liées aux phospholipides (-II) des protéines de la sous-famille GABARAP.
Figure 26 : Inhibition du flux autophagique dans les cellules HEK293, HEK293:FLAG-GABARAPL1- 6HIS et HEK293:FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS. Les cellules ont été incubées avec 50 mM NH4Cl
pendant 2 h ou avec 500 nM BafA1 pendant 16 h. Les cellules ont été lysées et les extraits protéiques totaux ont été chargés sur un gel 15 %. La révélation a été effectuée avec des anticorps dirigés contre les protéines GABARAPL1 et GABARAP (Chemicon, 1/1000e), Actine (1/3000e)et le kit de bioluminescence ECL Plus. (*) : signal correspondant à la protéine GABARAPL1 à 19 kDa.
149 Dans les cellules HEK293 incubées avec le NH4Cl ou la Bafilomycine A1 (pistes 2 et
γ), nous observons l’apparition d’un nouveau signal de taille inférieure à celui correspondant à la protéine GABARAP. Ce signal correspond à la forme modifiée liée aux phospholipides de GABARAP, GABARAP-II. En effet, il a été décrit que la liaison à des phospholipides accélère la migration des protéines modifiées en gel SDS-PAGE.
Dans les cellules HEK293:FLAG-GABARAPL1-6HIS incubées avec le NH4Cl ou la
Bafilomycine A1 (pistes 5 et 6), nous observons l’apparition de deux nouveaux signaux de tailles inférieures à FLAG-GABARAPL1-6HIS et GABARAP, respectivement. Ces signaux correspondent aux formes modifiées liées aux phospholipides, FLAG-GABARAPL1-II et GABARAP-II.
Dans les cellules HEK293:FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS incubées avec le NH4Cl ou la Bafilomycine A1 (pistes 8 et 9), nous observons l’apparition d’un seul nouveau
signal que nous avons déjà observé dans les cellules HEK293 sauvages. Ce signal correspond
à la forme liée aux phospholipides de GABARAP, GABARAP-II. Nous n’avons pas détecté
de forme liée aux phospholipides de la protéine FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS.
Ces résultats démontrent que la protéine FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS n’est pas
clivée et par conséquent qu’elle n’est pas liée aux phospholipides contrairement à ce qui a été démontré pour la protéine sauvage. Ce résultat confirme que le site de clivage de la protéine GABARAPL1 est la glycine 116 et que ce résidu est nécessaire pour sa conjugaison à un phospholipide et donc pour son rôle dans l’autophagie. Ces résultats nous permettent également de valider le modèle cellulaire établi. D’autre part, nous pouvons noter que les niveaux de la protéine mutée FLAG-GABARAPL1-G116A-6HIS sont légèrement supérieurs à ceux observés pour la protéine sauvage FLAG-GABARAPL1-6HIS dans les cellules non stimulées. Cela pourrait suggérer que cette mutation stabiliserait la protéine dans les cellules. Il sera intéressant de déterminer si ces résultats sont reproductibles et si cette stabilité accrue est liée à une inhibition de la dégradation de la protéine par autophagie ou par le protéasome.