La protéine Hfq est subdivisée en deux domaines : le domaine N-terminal comprenant les acides aminés 1 à 65 et le domaine C-terminal composé du reste des acides aminés [7]. Le domaine N-terminal est une région très structurée chez Hfq et extrêmement bien conservée entre les différentes espèces [7]. Les différentes structures cristallographiques de la protéine Hfq sont réalisées exclusivement à partir de ce domaine [21,31,325,334-342]. Les différentes études sur les interactions entre Hfq et les ARN semblent indiquer que ce domaine est essentiel pour ce type d’interaction. En effet, les différentes mutations altérant ce domaine, qui ont été étudié dans la littérature ou au cours de cette thèse, ont montré qu’elles pouvaient impacter plus ou moins fortement la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs [349,359,418]. A l’inverse du domaine N-terminal, le domaine C-terminale varie énormément d’une espèce à l’autre, notamment au niveau de sa taille pouvant aller de 7 acides aminés à plus d’une trentaine (Figure 25)[7]. Le rôle de ce domaine reste moins clair. Des travaux réalisés sur ce dernier ont montré qu’il ne semblait pas jouer un rôle dans la régulation des ARNm par des petits ARN régulateurs notamment dans la régulation de l’ARNm sodB par RyhB [459]. Mais il aurait un rôle dans la localisation cytoplasmique de la protéine ainsi que dans la structuration de cette dernière [460,461].
Il a semblé intéressant de se poser des questions sur la fonction du domaine C-terminal de la protéine en utilisant les différents systèmes de régulations Hfq-dépendants ARNm : petit ARN régulateur étudiés au laboratoire. Pour ce faire, j’ai, dans un premier temps, réalisé deux délétions différentes du domaine C-terminal d’Hfq en utilisant la technique de recombinaison λ-red. La première délétion comprenait l’intégralité du domaine, englobant les acides aminés 70 à 102 (HfqΔ70-102) (Figure 42). La seconde délétion conservait les 4 derniers acides aminés de la protéine (HfqΔ70-98) (Figure 42). En effet, des séquences de même type (EETE chez S. Typhimurium) se retrouvent généralement à la même position dans d’autres espèces, dont E. coli (EETE), S .aureus (ESSE) et B. subtilis (LELE) [7]. J’ai ensuite combiné ces différentes mutations par transduction avec les souches rapportrice chiP::lacZ, yifK::lacZ et
sodB::lacZ. Un dosage de l’activité β-galactosidase de l’ensemble des souches portant les gènes hfq sauvage, hfqΔ70-98, hfqΔ70-102 ou Δhfq fut réalisé.
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Le résultat de ces dosages a montré que l’effet de la délétion du domaine C-terminal n’impactait pas de la même façon l’expression des différents gènes rapporteurs (Figure 43 A). En effet, une grande différence est observable entre la souche rapportrice chiP régulé par ChiX et les souches rapportrices yifK et sodB régulés respectivement par GcvB et RyhB. Les différentes délétions d’Hfq ont un impact très important dans la régulation de chiP. La délétion HfqΔ72-98 affecte plus fortement la régulation de chiP que la délétion complète du domaine C-terminal faisant passer l’activité β-galactosidase de 75 unités de Miller en présence de l’allèle sauvage d’hfq à 1500 (facteur 20) et 700 (facteur 9) unités de Miller avec les allèles hfqΔ72-98 et hfqΔ72-102 respectivement. Malgré cela, cet effet reste relatif par
rapport à l’impact de la délétion d’Hfq qui entraine une augmentation de l’activité d’un facteur 150 passant à plus de 11000 unités de Miller. Les effets sont beaucoup plus faibles avec les rapporteurs yifK::lacZ et sodB::lacZ. Dans le cas de yifK, les délétions du domaine C-terminal d’Hfq entrainent une augmentation de l’activité du rapporteur de 120 unités de Miller à 260 et 200, soit un facteur 2 et 1.5 pour les allèles hfqΔ72-98 et hfqΔ72-102
respectivement. Finalement, avec l’ARNm sodB, l’activité passe de 70 à 260 unités de Miller avec l’allèle hfqΔ72-98 et à 330 unités de Miller avec l’allèle hfqΔ72-102, soit une augmentation d’un facteur 3.5 et 4.5 respectivement.
Figure 42 : Délétion du domaine C-terminal de la protéine Hfq
Séquences de la protéine Hfq sauvage ainsi que des différentes délétions réalisées au cours de cette expérimentation. Les séquences en vert et en bleu correspondant aux domaines N- terminal et C-terminal de la protéine respectivement et les séquences en rouges correspondent à l’épitope FLAG introduit dans certaines d’entre elles (voir ci-dessous).
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D’après les résultats de ces dosages, il semble que le domaine C-terminal peut jouer un rôle dans la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs. Cependant, le rôle du domaine C-terminal dans ce type de régulation semble difficile à identifier. Une partie des résultats obtenus pourrait être expliquée par une altération de la capacité de la protéine à former des hexamères d’Hfq fonctionnelle. Il y a toutefois, un résultat qui nous a Figure 43 : Impact de la délétion du domaine C-terminal d’Hfq dans la régulation des
ARNm chiP, yifK et sodB par les petits ARN régulateurs.
Activité β-galactosidase mesurée en unités de Miller et en phase exponentielle de croissance dans les souches A) chiP::lacZ, yifK::lacZ et sodB::lacZ en présence des allèles
hfq sauvage (hfq WT), hfqΔ72-98, hfqΔ72-102 et Δhfq. B) chiP::lacZ, yifK::lacZ et sodB::lacZ en présence des allèles hfqΔ72-102, hfqΔ72-102-FLAG, hfqΔ72-102-3xFLAG
et Δhfq.
A)
B) B)
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particulièrement interpellés. Nous avons observé que la régulation de chiP par ChiX est extrêmement perturbée par la délétion du domaine C-terminal mais cet effet est encore plus marqué dans les cas où les 4 derniers acides aminés de la protéine ont été conservés. Cet impact est-il dû à la présence d’une extension C-terminale inhabituelle ou dû au fait que cette petite extension soit particulièrement chargée pouvant entrainer une modification de la capacité de la protéine à lier les ARN? Pour répondre à cette question, j’ai construit deux allèles d’hfq dans lequel j’ai remplacé le domaine C-terminal de la protéine par une ou trois séquence FLAG (3xFLAG) formant ainsi une extension de 8 ou 22 acides aminés en suivant le protocole de recombinaison λ-red (Figure 42). Ces constructions ont été combinées avec les mêmes rapporteurs par transduction pour déterminer leurs impacts sur l’expression de ces derniers.
Les résultats du dosage de l’activité β-galactosidase nous montrent que seule la régulation de l’ARNm chiP est altérée en présence l’extension due à l’épitope 3xFLAG (Figure 43 B). En effet, la présence de l’épitope FLAG entraine une activité équivalente à celle obtenue dans la souche sans épitope ajouté. Par contre, la présence de l’épitope 3xFLAG entraine une augmentation de l’activité d’un facteur de 2.5x passant de 700 à 1500 unités de Miller (Figure 43 B). Avec les autres rapporteurs yifK et sodB, la présence d’une extension plus ou moins grande ne change pas leurs activités (Figure 43 B). Ceci semble indiquer que la régulation de ces ARNm se fasse de façon différente de celle de chiP.
Afin de compléter au mieux cette étude, nous avons introduit ces différents allèles d’hfq par transduction dans les souches yifKP1::lacZ et yifKP2::lacZ en présence des petits ARN régulateurs ChiX, GcvBX et RyhBX. Les dosages de l’activité β-galactosidase ont été réalisés dans ces différentes souches (Figure 44 A et B). Dans la totalité des cas, il semble que la délétion du domaine C-terminal induise une augmentation de l’activité β-galactosidase dans l’ensemble des souches (Figure 44 A et B). Par contre, suivant les souches, la présence de l’épitope 3xFLAG semble induire des effets variables sur la régulation des ARNm rapporteurs. Dans le cas du rapporteur yifKP1, la présence de l’épitope 3xFLAG par rapport à l’épitope FLAG provoque une augmentation d’un facteur 2 de son l’expression en présence des petits ARN ChiX et RyhBX passant ainsi de 150 à 310 unités de Miller et 80 à 180 unités de Miller respectivement (Figure 44 A). Avec GcvBX, l’activité est très proche de celle observée en présence de la délétion de la protéine Hfq (Figure 44 A). Avec le rapporteur
140 FLAG et hfqΔ70-102-3xFLAG (Figure 44 B). La présence de ces allèles diminue la capacité
de ChiX à réguler de yifKP2 entrainant une augmentation de l’activité du rapporteur qui passe de 300 à 520 et 750 unités de Miller respectivement (Figure 44 B). La régulation de d’ARNm
yifKP2 par GcvBX est également altérée mais aucune différence n’est observable entre la
présence du simple ou du triple épitopes FLAG faisant passer l’activité de 200 à 450 unités de Miller.
Figure 44 : Impact de la délétion du domaine C-terminal d’Hfq dans la régulation des ARNm yifKP1 et yifKP2 par les petits ARN régulateurs.
Activité β-galactosidase mesurée en unités de Miller et en phase exponentielle de croissance dans les souches A) yifKP1::lacZ en présence des petits ARN régulateurs ChiX, GcvBX et RyhBX ainsi que des allèles hfq WT, hfqΔ72-102-FLAG, hHfqΔ72-102-
3xFLAG et Δhfq. B) yifKP2::lacZ en présence des petits ARN régulateurs ChiX, GcvBX
et RyhBX ainsi que des allèles hfq WT, hfqΔ72-102-FLAG, hHfqΔ72-102-3xFLAG et
Δhfq. A)
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L’ensemble de ces résultats indique que la délétion du domaine C-terminal de la protéine Hfq impacte la régulation de tous les ARNm rapporteurs testés, avec des effets plus ou moins importants. Ainsi, la délétion du domaine C-terminal complet, a un effet sur la régulation de tous les ARNm rapporteurs. Ceci peut s’expliquer par le rôle de ce domaine dans la structuration de la protéine. L’absence du domaine pourrait entrainer une diminution de la quantité de la protéine sous forme fonctionnelle et donc diminuer sa capacité à médier la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs. Par contre, la présence d’une séquence courte et chargée (EETE) ou de l’épitope 3xFLAG en lieu et place de la séquence du domaine C-terminal altère très fortement la régulation de l’ARNm chiP ainsi que celle de yifKP1 alors que cela n’a que peu ou pas d’effet sur la régulation des ARNm sodB, yifK et yifKP2. La présence de ces épitopes semble également altérer la capacité de GcvBX de réguler l’ARNm
yifKP2. Les ARNm chiP et yifKP1 ainsi que le petit ARN GcvBX ont un le même motif
polyU permettant à l’ARN de se lier à la protéine Hfq alors que les ARN restants ont, eux, un site de fixation à Hfq de motifs (AAN)n ou A/U riche. Il est donc possible que les effets que nous observons dans ces cas soient dus à une même cause. L’absence d’impact sur la régulation des autres ARNm pourrait indiquer que l’effet observé est lié à un défaut dans la fixation de l’ARNm sur la protéine. Il est donc possible de supposer que la présence d’une queue non canonique à la place du domaine C-terminal de la protéine entrave la fixation de l’ARNm sur la face proximale de la protéine.
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