Lors de l’étude précédente, nous avons observé que l’ARNm yifKP1, possédant le site de fixation d’Hfq de chiP (site polyU), est régulé de manière extrêmement efficace par ChiX (facteur 200X). Alors que le petit ARN régulateur chimérique GcvBX, dérivée de GcvB, n’arrive que très peu à réguler cette même construction. A contrario, dans la souche portant
yifKP2, avec le site de fixation d’Hfq natif de yifK (motif (AAN)3), la régulation par les petits ARN ChiX et GcvBX est inversée par rapport à celle qui est observée chez l’ARNm yifKP1. En effet, GcvBX régule fortement yifKP2 (facteur 7) alors que ChiX le régule nettement moins efficacement. Bien que ces résultats puissent s’expliquer par les différences de séquences des sites de fixations d’Hfq des ARNm chimères par rapport aux petits ARN régulateurs, il existe d’autres changements au sein des séquences de ces ARNm, notamment la structure en tige-boucle en aval du site de fixation d’Hfq. En effet, lors de la construction de yifKP1, j’ai remplacé la séquence comprise entre le site de fixation d’Hfq et le site d’appariement de GcvB sur l’ARNm yifK par la séquence équivalente de chiP (Figure 38 A). Cette construction possède donc la structure en tige-boucle de chiP qui est différente de celle de yifK de par sa taille et par sa séquence. À l’inverse, lors de la construction de yifKP2, j’ai seulement remplacé la région d’appariement de GcvB de yifK par celle de ChiX chez chiP (Figure 38C). Ces différences de séquences, en plus de la différence du site de fixation d’Hfq, pourraient avoir un rôle dans la régulation de nos ARNm. Nous avons donc vérifié si la structure en tige-boucle en aval du site de fixation d’Hfq dans les ARNm yifKP1 et yifKP2 jouait un rôle dans la régulation par les petits ARN régulateurs ChiX et GcvBX.
Afin de vérifier cela, j’ai construit deux nouveaux ARNm chimères yifKP4 et yifKP5 pour vérifier notre hypothèse. Ces constructions ont été réalisées en suivant le protocole de recombinaison sans cicatrice à partir des souches portant yifKP1::lacZ et yifKP2::lacZ . La première chimère, yifKP4, est dérivée de yifKP1, mais possède le site de fixation d’Hfq de yifK à la place de celui de chiP, mais conserve la structure en tige-boucle de chiP (Figure 38 A). La seconde chimère, yifKP5, a été construite à partir de yifKP2, mais en remplaçant le site de fixation d’Hfq au motif (AAN)3 par le motif polyU de chiP (Figure 38 C). J’ai ensuite
transféré ces constructions par transductions dans différentes souches pour étudier leurs régulations par les différents petits ARN régulateurs.
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Figure 38 : Régulation de yifKP4 et yifKP5 par les petits ARN régulateurs ChiX, GcvBX et RyhBX.
A)
C)
B)
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Finalement, j’ai réalisé un dosage de l’activité β-galactosidase de ces différentes constructions en présence des petits ARN régulateurs ChiX, GcvBX et RyhBX afin de les comparer aux résultats obtenus avec les ARNm yifKP1 et yifKP2 (Figure 38 B et D). L’analyse de ces résultats montre qu’en remplaçant le site de fixation d’Hfq poylU de yifKP1 par le site de fixation d’Hfq (AAN)3 de yifK, la régulation de cet ARNm a drastiquement
changé. En effet, yifKP1 est très bien régulé par ChiX et RyhBX et très peu par GcvBX alors qu’yifKP4 présente une régulation opposée sauf pour RyhBX. En effet, il est très bien régulé par GcvBX passant de 920 à 210 unités de Miller entre les ARNm yifKP1 et yifKP4 respectivement (Figure 38 B). A contrario, ChiX ne réprime pas yifKP4 (276 unités de Miller) aussi bien qu’il ne le fait pour yifKP1 (8 unités de Miller). Enfin, RyhBX régule très efficacement les deux ARNm sans montrer de réelle différence d’expression du rapporteur passant de 6 unités de Miller avec yifKP1 à 16 unités de Miller chez yifKP2 (Figure 38 B).
L’effet inverse est observable en remplaçant le site de fixation d’Hfq (AAN)3 de yifKP2
par le site de fixation d’Hfq polyU de chiP. En effet, dans ce cas, la régulation de yifKP5 par ChiX est plus efficace passant de 270 à 55 unités de Miller entre les ARNm yifKP2 et yifKP5 (Figure 38 D). En parallèle, la régulation de l’ARNm yifKP5 par GcvBX est moins efficace que celle de yifKP2, passant de 130 à 1000 unités de Miller chez yifKP2 et yifKP5 respectivement (Figure 38 D). Ici aussi, la régulation par RyhBX n’est que très peu altérée par A) Représentation des séquences et structures secondaires des ARNm yifKP1 et yifKP4. Le site de fixation d’Hfq polyU de chiP est surligné en orange claire, le site de fixation d’Hfq de motif (AAN)3 de yifK est surligné en vert. Le site d’appariement de ChiX est surligné en orange foncé. La séquence de SD est surlignée en rouge et l’AUG initiateur est sous- ligné en bleu clair. B) Activité β-galactosidase mesurée en unités de Miller et en phase exponentielle de croissance dans les souches yifKP1::lacZ et yifKP4::lacZ en présence des petits ARN régulateurs ChiX, GcvBX et RyhBX ou en leurs absences. C) Représentation des séquences et structures secondaires des ARNm yifKP2 et yifKP5. Le site de fixation d’Hfq polyU de chiP est surligné en orange claire, le site de fixation d’Hfq de motif (AAN)3 de yifK est surligné en vert. Le site d’appariement de ChiX est surligné en orange foncé. La séquence de SD est surlignée en rouge et l’AUG initiateur est sous-ligné en bleu clair. D) Activité β-galactosidase mesurée en unités de Miller et en phase exponentielle de croissance dans les souches yifKP2::lacZ et yifKP5::lacZ en présence des petits ARN régulateurs ChiX, GcvBX et RyhBX ou en leurs absences.
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le changement du site de fixations à Hfq. En effet, ce dernier entraine une légère diminution de la capacité de RyhBX à réguler l’ARNm faisant passer l’activité du rapporteur de 6 unités de Miller chez yifKP2 à 30 unités de Miller chez yifKP5 (Figure 38 D)
Ces résultats nous ont permis de confirmer que le changement du site de fixation d’Hfq peut modifier la régulation d’un ARNm par rapport à un petit ARN régulateur donné. Bien que ces résultats confortent notre hypothèse, il semble que la structure en tige-boucle pourrait aussi jouer un rôle, bien que non-essentiel, dans la régulation. En effet, l’ARNm yifKP4 est moins bien régulé par GcvBX que ne l’est yifKP2 alors qu’en même temps, yifKP5 est moins bien régulé par ChiX qu’yifKP1. À la différence des autres petits ARN régulateurs, RyhBX est déjà capable de réguler aussi efficacement yifKP1 et yifKP2. Les changements au niveau des sites de fixations à Hfq sur ces ARNm ne modifient que très peu sa capacité à les réguler, bien qu’ils aient un léger impact. Pourtant, les sites de fixations d’Hfq et d’appariement des petits ARN sont les mêmes. Les différences de séquences résident principalement dans la structure en tige-boucle qui diffère d’un ARNm à l’autre. Les reconnaissances entre les ARNm et leurs petits ARN régulateurs et le résultat de l’interaction qui en découle semblent donc suivre des règles plus complexes qu’ils n’y paraissent.
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