l’hypothèse.
J’ai voulu vérifier l’existence d’une possible régulation par GcvB faisant intervenir une terminaison prématurée de la transcription au niveau de dppA ou de la région entre dppA et dpnt. Tout d’abord, j’ai construit différentes souches dans lesquels j’ai introduit un gène codant un ARNt de S. aureus dans la région intergénique entre les gènes dppA et dpnt (Figure 47 A et B). En effet, si le(s) site(s) ruts putatifs pouvaient effectivement agir en tant que tel(s), la fixation de GcvB pourrait induire une terminaison prématurée Rho-dépendante de la transcription et résultant dans une faible expression des rapporteurs. Afin d’être le plus complets dans notre étude, les rapporteurs ont été insérés dans trois souches différentes. La première souche est une souche sauvage pour dppA (dppA WT). La seconde est une souche où le site rut putatif de dppA a été éliminé (dppA Δrut). La dernière est une souche où le codon initiateur AUG de dppA a été muté en AGG (dppAAGG). Cette souche permet de mimer
et d’amplifier les effets de la fixation de GcvB sur dppA en inhibant la traduction de ce dernier. Ces différentes constructions ont été combinées par transduction avec une délétion du gène gcvB pour les souches dppA WT et dppAΔrut et avec le mutant Y80C du facteur Rho dans le cas de la souche dppAAGG.
Ces différents contextes génétiques devraient permettre d’explorer la régulation de l’opéron dppABCDF par GcvB pour déterminer si elle entraine une terminaison prématurée de la transcription Rho-dépendante. Selon cette hypothèse, l’expression de notre rapporteur doit augmenter en absence GcvB dans la souche dppA WT alors que dans ce même contexte, la souche dppA Δrut devrait avoir une expression équivalente de l’ARNtS.a.. Dans la souche
dppAAGG, l’activité des rapporteurs doit fortement augmenter en présence de l’allèle mutant de
Rho. L’analyse de l’expression de notre ARNtS.a.
rapporteur dans les différents contextes rouge) et %G (en bleu) en fonction de la séquence nucléotidique de dppA. Les sites rut potentiel sont ainsi représentés par une bulle où le taux de C est supérieur à celui de G. La séquence mise en avant correspond au site rut potentiel présentant le plus fort ratio C : G présent au début du gène dppA. Chaque séquence surlignée en jaune correspond à un site qui aurait le potentiel d’interagir avec une des sous-unités du facteur Rho. Les groupes de sites marqués d’une étoile verte correspondent au site rut potentiel. La flèche noire indique un second site rut potentiel dont le ratio de C : G est plus faible.
168
génétiques a été réalisée par des expériences de Northern blot (Figure 48 A). Les résultats de
Figure 47 : Construction des souches rapportrices ARNtS.a. et lacZ
Représentation schématique des différentes étapes permettant l’introduction de nos différents rapporteurs transcriptionnels ARNtS.a.et lacZ. A) Un module contenant le gène codant l’ARNtS.a. ainsi que le gène cat flanqué de deux sites FRT (en violet) est amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides K22-J84 en utilisant la souche MA11182 comme ADN matrice. B) Le produit de PCR a été ensuite insérer dans la région intergénique entre dppA et dpnt en utilisant la technique de recombinaison médié par λ red apporté par pKD46. C) le plasmide pCP20 est ensuite introduit dans la souche ainsi formé par transformation. D) Le gène cat est excisé par recombinaison des sites FRT par la Flp- recombinase présente sur pCP20. E) Le plasmide pCE37 est introduit dans la souche par transformation. F) Le plasmide pCE37 est insérer dans la souche par recombinaison entre le site FRT présent dans la région intergènique dppAB et le site FRT présent sur le
169
ces derniers montrent que dans les souches dppA WT et dppA Δrut, la délétion du petit ARN régulateur GcvB induit une augmentation de l’expression de l’ARNtS.a.
rapporteur. Par contre, dans la souche dppAAGG où nous avons mimé l’effet de la fixation de GcvB, l’expression de
notre rapporteur est très faible et ne montre que peu de différence d’expression en présence de l’allèle de rho WT ou Y80C par rapport à ce que nous pouvions attendre.
Ces résultats ne sont pas concordants avec ceux que nous pouvions attendre de ces expériences. En effet, seule la souche dppA WT présente un résultat conforme à ceux que nous attendions. A l’inverse, les deux autres souches ont des résultats différents de notre hypothèse. Nous nous sommes alors demandés si notre rapporteur était suffisamment sensible pour voir les effets que nous supposions. En effet, lorsque nous avons utilisé l’ARNtS.a. comme rapporteur dans nos expériences précédentes, l’expression de l’ARNm chiPQ était très forte. Or, dans ce cas, l’opéron dppABCDF est beaucoup moins exprimé dans la cellule et cette faible expression conjuguée à un rapporteur peu sensible pourrait expliquer pourquoi nous ne voyons aucun effet dans la souche dppAAGG. Nous avons donc utilisé un rapporteur
transcriptionnel plus sensible : le gène lacZ.
À partir des souches obtenues précédemment, j’ai construit les souches avec le rapporteur
lacZ en suivant les étapes indiquées dans la Figure 47 C-F. Ces souches ont ensuite été
combinées par transduction avec le mutant Y80C du facteur Rho. L’étude des résultats du dosage de l’activité β-galactosidase montre une augmentation de l’expression, quel que soit le contexte génétique dans lequel il est étudié, en présence de l’allèle du mutant rho Y80C par rapport aux souches où l’allèle de rho est sauvage (Figure 48 B). En effet, l’activité mesurée pour la souche où dppA est sauvage augmente d’un facteur 3.5 en présence du mutant de Rho passant de 32 à 114 unités de Miller. Elle augmente également d’un facteur 3 dans la souche
dppA Δrut (39 à 109 unités de Miller) et d’un facteur 5 dans la souche dppAAGG (8 à 42 unités
de Miller) dans les mêmes conditions. Ces résultats semblent aller à l’encontre de l’idée originelle puisque la souche dppA Δrut est autant affectée par le mutant Rho Y80C que la souche sauvage.
transformation. D) Le gène cat est excisé par recombinaison des sites FRT par la Flp- recombinase présente sur pCP20. E) Le plasmide pCE37 est introduit dans la souche par transformation. F) Le plasmide pCE37 est insérer dans la souche par recombinaison entre le site FRT présent dans la région intergènique dppAB et le site FRT présent sur le plasmide pCE37 grâce à la Flp-recombinase présent sur pCP20.
170
Ces résultats, comme ceux obtenus précédemment, sont en désaccord avec l’hypothèse de départ. Il existe de nombreuses incohérences entre les résultats obtenus à partir de nos différents rapporteurs surtout dans la souche dppAAGG. En effet, dans cette souche, nos
rapporteurs présentent des résultats opposés. Dans le cas du rapporteur ARNt, aucune différence n’est observable entre les allèles sauvages et mutants du facteur Rho. Alors qu’à l’inverse, le gène rapporteur lacZ présente une augmentation de son expression d’un facteur 5 en présence du mutant Y80C de Rho. De plus, l’ensemble des résultats des dosages de l’activité β-galactosidase dans les différentes souches montre un effet du mutant Rho dans l’expression du rapporteur relativement fort. Ceci semble indiquer qu’il existe un site rut en amont des gènes lacZ, mais qui ne correspond pas au site rut potentiel que nous avions identifié. A l’inverse, les résultats, lors de l’analyse de l’ARNtS.a., ne nous ont pas permis de
Figure 48 : Etude des rapporteurs dans les souches dppA WT, dppA Δrut et dppAAGG A) Détection du transcrit ARNtS.a. par northern blot réalisé avec les extractions d’ARN totaux prélevé en phase exponentielle de croissance (DO600nm=0.4). B) Activité β-
galactosidase mesurée en unité de Miller et en phase exponentielle de croissance dans les contextes dppA WT, dppA Δrut et dppAAGG en présence du facteur Rho WT ou du facteur
Rho mutant Y80C. C) Représentation schématique de la position et de la séquence du site
rut artéfactuel. Le gène codant l’ARNtS.a. est représenté en bleu foncé, le gène lacZ est représenté en bleu claire, le site FRT est représenté en violet et le site rut potentiel est représenté en vert.
A)
B)
171
confirmer la présence de site rut au sein de dppA. Cela semble donc impliquer que ce site rut pourrait se trouver entre le gène codant l’ARNtS.a. et lacZ.
Afin de confirmer cela, nous avons analysé les séquences nucléotides des constructions. Nous avons identifié un site rut potentiel présent effectivement entre le gène codant l’ARNtS.a. et le gène lacZ et plus précisément, sa séquence englobe la fin du gène codant l’ARNtS.a. jusqu’à la moitié du site FRT (Figure 48 C). Nous nous sommes alors demandé d’où pouvait provenir ce site. L’étude de la séquence de ce site rut potentiel nous a permis de remonter à ses origines. Sa présence en amont de ce site indique que le site rut était présent dans notre séquence avant l’insertion des gènes lacZ et donc de pCE37. Effectivement, en analysant les séquences de nos différentes constructions, nous nous sommes rendu compte que le site rut était déjà présent dans le module ARNtS.a. / cat. Plus précisément, les origines du site rut potentiel proviendraient de séquences provenant de l’ARNtS.a.
(TCCATGGT) et du plasmide pKD3 (CCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTA dont la partie soulignées correspond au début du site FRT) ayant servi à construire le module [464].
Les résultats que nous avons obtenus au cours de nos expériences nous permettent de conclure que le site rut potentiel que nous avons identifié au sein de dppA n’est pas un site rut réel. Il semble cependant exister au moins un autre site rut potentiel au milieu de la séquence de dppA bien que la bulle %C : %G soit plus faible (Figure 46 C). L’ensemble des données acquises ne nous permet pas de valider ou d’infirmer notre hypothèse de départ. Ainsi, le mécanisme permettant au petit ARN régulateur GcvB de réguler l’ensemble de l’opéron
172