Réduction et interprétation des données

Les données SANS brutes ont été réduites (par rapport à l’efficacité du détecteur, le bruit de

fond électronique et la diffusion du porte-échantillon) et intégrées sur une image bidimensionnelle en utilisant le logiciel GRASP de l’ILL (Dewhurst, 2002). Les spectres

d’émission de la fluorescence de la GFPssrA ont été extraits à partir des fichiers Nexus en

utilisant le logiciel HDFview (https://www.hdfgroup.org/products/java/hdfview/).

Pour les données SANS et SAXS les intensités du tampon ont été soustraites des intensités des échantillons respectives en utilisant le logiciel PRIMUS (Konarev et al, 2003). Les rayons de girations Rg de tous les échantillons ont été extraits en utilisant l’approximation de Guinier

(Guinier, 1939) (Eq. 1.15) avec le même programme. La validité de l’approximation de

Guinier a été vérifiée dans chaque cas (sauf pour les agrégats de la GFP). Pour la validation des modèles pseudo-atomiques et des modèles Cryo-EM, CRYSOL/CRYSON (Svergun et al, 1995) (Svergun et al, 1998) ont été utilisés pour ajuster les courbes de diffusion théoriques calculées à partir des modèles dans les courbes SAXS/SANS expérimentales. Comme

l’intensité diffusée observée dans les expériences SAS est la transformé de Fourier moyennée

sur toutes les orientations de la densité de longueurs de diffusion ߩ௡ ^{ou de la densité}

électronique ߩ_௘ des particules dans la solution, les courbes de diffusion théoriques peuvent être calculées si ߩ_௡ ou ߩ_௘sont connus. Avec l’aide des programmes CRYSOL (pour les

rayons X) et CRYSON (pour les neutrons), qui font partie du paquet ATSAS (http://www.embl-hamburg.de/ExternalInfo/Research/Sax/software.html), les courbes de diffusion théoriques peuvent être calculées à partir des fichiers pdb. Le programme EM2DAM (Petoukhov et al, 2012) a été utilisé pour générer les fichiers pdb à partir des fichier CCP4 des cartes de densité électronique. Les courbes obtenues sont très utiles pour l’interprétation des

données expérimentales ou pour vérifier si le modèle structural du fichier pdb correspond à la structure de la protéine en solution.

Pour la visualisation structurale ainsi que la validité des modèles, DAMMIF (Franke & Svergun, 2009) et DAMMIN (Svergun, 1999) ont été utilisés pour générer des modèles ab initio en billes en utilisant GNOM (Svergun, 1992). Les masses moléculaires et l’état

d’oligomérisation des complexes ont été mesurés à partir des données SAXS par calibration

relative avec une protéine standard, la BSA, à 4 mg/ml en utilisant les intensités I(0) respectives (Mylonas & Svergun, 2007).

Pour l’expérience de dépliement de la dGFPssrA par hPAN (Fig. 3, chapitre 5.2), le

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volumiques de chaque espèce pendant le dépliement (agrégats et GFPssrA natives). Les facteurs de forme de chaque espèce ont été générés par ffmaker (du package OLIGOMER) et utilisés par OLIGOMER pour le calcul des proportions.

Intérêt de la technique SANS dans le cas de notre projet

L’étude de la dynamique et des changements conformationnels du complexe PAN et de son

substrat modèle, la GFPssrA, pendant le processus de dépliement était un objectif principal lors de ma thèse. Dans les deux dernières décennies la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) a subi une énorme évolution au niveau du développement instrumentale et applications aux systèmes biologiques (Thomas et al, 2016). Toutefois, SANS était moins utilisée que SAXS et il y avait moins de développement au niveau des instruments dédiés aux applications biologiques. Vu la complexité du système PAN:GFPssrA en terme de taille (300 kDa) et de sa grande flexibilité en solution, SANS, combinée avec deutération et variation de contraste, est une des rares techniques capables de fournir des données structurales en solution en permettant de distinguer les différents partenaires. En se basant sur le principe de la variation de contraste en SANS (paragraphe 2.2) et en prenant comme exemple le système utilisé lors de ma thèse (MjPAN:GFPssrA), lorsque une des deux protéines est deutérée et

l’autre hydrogénée, la protéine deutérée possède la densité de longueurs de diffusion la plus

élevée alors que la protéine hydrogénée possède une densité de longueurs de diffusion égale à un mélange 42% D2O /58% H2O dans le tampon et ainsi un tel mélange masquera donc le signal de la protéine hydrogénée et la courbe de diffusion enregistré dans ce cas correspond uniquement au signal de la protéine deutérée sans contribution de son partenaire hydrogénée en solution (Fig. 38). Ceci permet de mesurer des informations structurales sur chaque protéine dans le complexe et donc suivre sa dynamique et son changement conformationel après formation du complexe et pendant le processus de dépliement en temps réel. Deux combinaisons du complexe (MjPAN:GFPssrA) ont été effectuées, MjPAN deutérée et GFPssrA hydrogénée avec 42 % D2O dans le tampon. Dans ce cas la GFPssrA est masquée et seul le changement conformationel de MjPAN est suivie ou bien MjPAN hydrogénée et GFPssrA deutérée avec 42 % D2O dans le tampon et dans ce cas c’est le signal de MjPAN qui est masqué et le changement conformationel de la GFPssrA est suivi pendant le dépliement. Les deux combinaisons utilisées sont schématisées dans la figure 39.

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Figure 38 :diffusion aux petits angles (neutrons et rayon X) sur un complexe formé entre une protéine

deutérée et une autre non-deutérée : l’expérience de la variation de contraste. La figure illustre la

variation de contraste en utilisant une structure (PDB : 3GMR) d’une ‘T-cell surface glycoprotein CD1d1’

en complexe avec ‘beta-2-microglobulin’. (A) les protéines ont chacune la même densité électronique et donc la même densité de diffusion des rayons X. Le profil de SAXS par conséquent donne des informations sur la forme du complexe entier comme une particule de contraste uniforme (représenté en noir). (B) le contraste de diffusion de neutrons des composants deutérés (noir) et non-deutérés (gris) est différent, et il est

donc possible de mesurer la diffusion de chaque composant individuel par ‘contrast matching’ en changeant

la composition H/D du solvant. La protéine non-deutérée sera ‘matchée’ à environ 40% D2O, alors que la

protéine deutérée sera ‘matchée’ à 90% D2O, cette valeur dépend du niveau de deutération de la protéine (60% dans cet exemple) (Jacques & Trewhella, 2010).

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Le court temps d’exposition de 30 secondes utilisé pour la collecte des données sur les

partenaires deutérés lors de la cinétique de dépliement a permis de collecter un grand nombre de profils SANS pendant un temps court de dépliement essentiel pour suivre le processus avec

une courte échelle de temps portant beaucoup d’informations structurales et dynamiques sur

le complexe PAN et son substrat pendant les toutes premières minutes du début de la réaction. Il faut également souligner que l’utilisation des systèmes d’archées hyperthermophiles comme

modèles d’étude dans le cadre de notre étude en temps réel par SANS a fourni un avantage

essentiel pour le projet en raison de la thermoactivation du complexe PAN permettant de mieux contrôler la cinétique enzymatique et le processus de dépliement.

Pour conclure, des mesures de fluorescence de la GFPssrA, couplées à la collecte des courbes SANS (Fig. 37), ont fourni beaucoup d’informations supplémentaires sur le processus

Figure 39 :représentation schématique des deux possibilités de variation de contraste utilisées dans notre

cas d’étude. dPAN hGFP Solvant 42 % D2O ρ(hPAN) = ρ(solvant) hPAN ^dGFP Solvant 42 % D2O ρ(hGFP) = ρ(solvant)

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permettant de faire la connexion entre le dépliement de la GFPssrA du point de vue structural et la perte de sa fluorescence due à la déstabilisation du fluorophore, protégé à l’intérieur du

tonneau β de la protéine. La combinaison de cette approche couplée, combinée avec d’autres

techniques biochimiques et structurales utilisées durant ma thèse (microscopie électronique, SAXS, cristallographie aux rayons X, SPR, voir chapitres 3 et 4) a constitué un outil puissant pour réaliser une caractérisation structurale, fonctionnelle et dynamique du système PAN qui

nous a permis d’éclaircir le mode d’action de cette machine moléculaire et de gagner des

informations précieuses sur le mécanisme des AAA+ unfoldases et du complexe d’activation

du protéasome eucaryote (19S) (voir les deux chapitres résultats 5.1 et 5.2).