4 MATERIELS ET METHODES BIOCHIMIQUES
4.2.1 Adaptation des bactéries et culture par fermentation
Les plasmides et la souche bactérienne utilisés pour la production des protéines deutérées sont les mêmes que ceux utilisés pour l’expression des protéines hydrogénées (voir paragraphe 4.1.1). Les milieux composés de D2O et d’une source carbonée (d8-glycérol) étant très couteux, une stratégie de culture à haute densité « high cell density culture » est utilisée. Cela
permet d’obtenir un haut rendement de biomasse par volume et par conséquence un haut
rendement de protéines recombinantes deutérées. Le milieu choisi pour la fermentation est le milieu minimum Enfors (Xu et al, 1999) (Table 5 et 6) que l’on peut produire sous sa forme
hydrogénée ou deutérée. La souche utilisée BL21(DE3) ne présentant pas d’auxotrophie peut
pousser dans ce type de milieu. Pour garantir la stabilité du plasmide recombinant, par
conséquence l’expression de la protéine, le marqueur de résistance à la kanamycine est
préféré à l’ampicilline. En effet, la β-lactamase responsable pour la résistance à l’ampicilline a
tendance à traverser la membrane extérieure vers le milieu, conduisant à une perte de sélection pour les bactéries recombinantes.
95 Quantité (Pour 1 litre) Milieu Enfors Concentration (g/litre) Solution minérale 6,86 g 1,56 g 6,48 g 0,49 g 1 ml 1 ml 5 g 3 ml qsp 1 litre CaCl2.2H2O FeCl3.6H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O EDTA.Na2 0,5 16,7 0,18 0,16 0,15 0,18 20,1 (NH4)2SO4 KH2SO4 Na2HPO4 anhydre (NH4)2-H-Citrate MgSO4 1M (D2O) Solution minérale 1000X (D2O)
Glycérol 100% (deutéré) Kanamycine 10 mg/ml (D2O)
D2O
Table 5 : Composition du milieu minimum Enfors pour la croissance des bactéries. Le glycérol fait
office de source unique de carbone. L’utilisation conjointe de D2O et de glycérol deutérée permet d’avoir un
taux de deutération proche de 100%. qsp : quantité suffisante pour.
Table 6 : Composition de la solution minérale 1000X. La préparation de la solution sous sa forme
deutérée sera précédée d’un échange de tous les hydrogènes labiles contenus dans les poudres
commerciales. La solution du MgSO4 et la solution minérale sous leurs formes deutérées nécessitent un
échange de tous les hydrogènes labiles. Les poudres sont solubilisées dans du D2O et évaporées plusieurs
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Afin d’optimiser l’adaptation et la croissance des bactéries en milieu Enfors minimum
deutéré, les étapes suivantes ont été effectuées (Fig. 44) :
ü Croissance des bactéries sur une boite de LB-agar.
ü Inoculation d’une colonie dans 10 ml de milieu Enfors hydrogéné sur la nuit à 37 °C.
ü Inoculation au 1/10 de 10 ml de milieu Enfors deutéré de la culture précédente. Cette étape est réalisée 5 à 6 fois pour obtenir une croissance optimale en milieu minimum.
ü Inoculation au 1/10 de 150 ml de milieu Enfors de la culture précédente. Cette
dernière étape permet d’obtenir la préculture nécessaire pour inoculer le fermenteur
qui servira après pour la croissance des bactéries et l’expression de la protéine.
Comme le milieu d’expression doit être perdeutéré (milieu 100% deutéré), les passages sont
effectués en premier lieu en milieu hydrogéné, pour ensuite être faits en milieu deutéré.
La culture est faite en biofermenteur Labfors II (Infors) de 2,5 l, inoculée par une préculture au 1/10. Durant toute la fermentation, le pD, stabilisé à 6,9, la pO2 du milieu (oxygène dissous dans le milieu), avec pour valeur de consigne 30%, et la température (30 °C) sont contrôlés et régulés. La fermentation se déroule en trois phases (Fig. 45):
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La première est qualifiée de « Batch »: le but de cette première phase est d’initier la
croissance des bactéries. La source de carbone est le d8-glycérol présent dans le milieu de culture en concentration limitante de 5g/l.
Une fois que tout le glycérol consommé, on observe à une acidification progressive jusqu’au
point de consigne (pD=6,9) du milieu et une augmentation brutale de la pO2. Cette
augmentation indique l’arrêt de la consommation d’oxygène de la bactérie, par manque de
source de carbone. Il devient alors nécessaire de supplémenter à intervalles régulières le milieu en glycérol tout au long de la deuxième phase, dite de « Fed-Batch ». Cette seconde phase consiste à soutenir la croissance des bactéries et à augmenter d’une façon contrôlée la biomasse tout en évitant la production d’acides (acide acétique par exemple). La supplémentation du milieu en source de carbone se fait avec une solution d-Enfors (D2O) avec 120 g/l de glycérol deutéré, appelée ‘solution de feeding’. L’intervalle entre chaque ajout de milieu et la quantité délivrée doivent être définis de manière à ne pas restreindre la croissance bactérienne. En parallèle de l’ajout de glycérol, le pD est maintenu à 6,9 par ajout de NaOD via une pompe contrôlée automatiquement.
La phase d’« Induction »: une fois la densité optique (DO) ayant atteint 10-12, une induction à 1 mM IPTG (D2O) est effectuée. Cette induction se poursuit pendant une nuit. Cette durée est définie préalablement grâce aux tests d’expression réalisés à petite échelle en milieu deutéré. Les bactéries sont récoltées vers des densités optiques proches de 16. En moyenne, 50 à 70 g de pâte bactérienne est récoltée pour 2 l de milieu dans le fermenteur. Par comparaison, un litre de milieu LB à 37 °C produit 3-4 g de pâte bactérienne.
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4.2.2 Purification et hexamérisation
Les protéines deutérées MjPAN et GFPssrA ont été purifiées (et hexamérisées, pour PAN) selon le même protocole et dans les mêmes tampons que les protéines hydrogénées (voir paragraphe 4.1.3). Tous les tampons utilisés pendant la purification des protéines deutérées sont préparés avec du H2O.
Figure 45 : profile de fermentation et photo d’un
fermenteur pendant la production des protéines deutérées au D-lab.
(A) profile de fermentation obtenue pour la culture de
MjPAN deutérée. Mise en évidence des trois phases de
fermentation (Batch, Fed-Batch et Induction) définies dans la section 4.2.1. Courbe bleu foncée : pourcentage
d’oxygène dissous dans le milieu. Courbe rouge:
vitesse d’agitation du milieu. Courbe bleu claire: quantité de soude ajoutée. Courbe orange : quantité de solution de feeding ajoutée. Courbe noire : densité
optique mesurée. (B) photo du fermenteur contenant
des cellules exprimant la GFPssrA deutérée.
A
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ATP, MgCl2
65 °C Activité enzymatique
La protéine PAN est en effet une enzyme qui catalyse le dépliement des protéines substrat en
présence d’ATP comme source d’énergie et Mg2+ comme cofacteur (Benaroudj & Goldberg,
2000). Durant ma thèse le substrat utilisé était la GFPssrA, une fusion entre la protéine native (« wild type », wt) GFP « Green Fluorescent Protein », et un tag de 11 résidus (tag « ssrA » : AANDENYALAA) du côté C-terminal permettant l’adressage et la reconnaissance de la
protéine par PAN (Weber-Ban et al, 1999):
PAN + GFPssrA PAN + GFPssrA dépliée