Discussion et perspectives

Ce travail a apporté plusieurs nouvelles perspectives sur le complexe d’activation du

protéasome chez les archées (PAN) qui pourraient également porter des informations importantes sur son homologue eucaryote plus sophistiqué (le complexe 19S), en particulier la base du complexe comportant les sous-unités formant l’hexamère ATPase (Fig. 7, chapitre 1.4). Nous avons tout d’abord montré qu’une forme courte du complexe PAN dépourvue de

34 et de 31 acides aminés de son côté N-terminal est présente in vivo chez P. horikoshii et P. abyssii respectivement. Cette forme courte montre une activité de dépliement des substrats protéiques globulaires (la GFPssrA) et une solubilité en solution absente chez la forme longue

du complexe. Ces résultats indiquent que l’hétérogénéité de l’extrémité N-terminale

représente probablement une stratégie de régulation chez les procaryotes pour les ATPases

impliquées dans la protéolyse intracellulaire. Malheureusement, tous nos essais d’exprimer et

de purifier la forme longue de PhPAN ont échoué à cause de son insolubilité en solution une fois que le complexe est exprimée dans E. coli. Cette difficulté nous a empêchés de comparer son activité et sa structure avec la forme courte détectée in vivo.

Nos études structurales sur la forme courte du complexe ont révélé une nouvelle architecture des AAA+ régulatrices de la protéolyse qui est plutôt conservée entre archées et eucaryotes (Fig. 5, chapitre 5.1) et qui est remarquablement différente des régulateurs bactériens (ClpX et HslU). Nous avons pu générer un modèle Cryo-EM à 10-15 Å de résolution (Fig. 2, chapitre 5.1), qui a ensuite été utilisé pour générer un modèle pseudo-atomique avec les structures cristallographiques du domaine C-terminal ATPase monomérique et du domaine N-terminal sous sa forme hexamérique. Les deux modèles (Cryo-EM et pseudo-atomique) ont ensuite été validés en solution par SAXS. Notre modèle consiste à une structure sous forme d’un

hexapode avec six bras sortant du domaine C-terminal et un corps central contenant une grande cavité ouverte vers le protéasome 20S.

Cette nouvelle architecture n’a pas été observée dans les autres modèles de PAN à basse

résolution déjà publiés et souligne une forte conservation structurale entre les complexes unfoldases des archées et des eucaryotes (Fig. 5, chapitre 5.1) indiquant des mécanismes similaires pour le dépliement des substrats protéiques ainsi que pour les changements de conformations induits par liaison et hydrolyse de nucléotides. Afin de mieux caractériser ces changements, nous avons généré deux modèles Cryo-EM basse résolution de PhPAN en absence ou en présence d’ATPγS (Fig. 4, chapitre 5.1). Une simple comparaison entre ces deux structures montre clairement le changement de conformation dramatique induit par la

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liaison de l’ATPγS qui a abouti à une contraction globale de la molécule et une diminution

dramatique du volume de la cavité centrale ainsi que des diamètres des domaines N-terminal et C-terminal.

Nos données structurales et dynamiques ainsi que nos observations biochimiques ont été très

utiles pour proposer un mécanisme et un mode d’action de PAN pendant le dépliement des

substrats. Le mécanisme le plus probable qu’on peut proposer sur la base de nos données est

que le dépliement du substrat se fait indépendamment de la translocation dans la partie catalytique 20S et que ce dépliement favorise l’association transitoire entre PAN et le 20S (Fig.4, chapitre 5.1). Ce modèle nous a amené à privilégier un mécanisme où PAN fonctionne sur la surface du protéasome 20S mais sans translocation par étape progressive. Bien que ce mécanisme semble être le plus réaliste, d’autres études dynamiques et structurales sont encore

nécessaires sur les complexes PAN-substrat et PAN-20S pour mieux comprendre le processus de dépliement ainsi que le rôle de chaque partenaire. Les informations structurales et mécanistiques sur PAN fournies dans ce papier nous donnent pourtant des informations

précieuses sur le mécanisme d’action de ces larges machines moléculaires ainsi que sur le

mode d’action du protéasome 26S eucaryote et en particulier la partie ATPasique qui forme la

152

Etude des mécanismes de dépliement et de dégradation des

protéines par le système PAN-Protéasome de l’archée

Methanocaldococcus Jannaschii : mise au point d’une approche

en temps réel par diffusion de neutrons aux petits angles

5.2.1 Présentation du travail

Le travail présenté dans le chapitre précédent sur l’étude structurale par cryo-microscopie électronique du complexe PAN de P. horikoshii a fourni des informations intéressantes sur

l’architecture globale et la structure des complexes PAN régulatrices de la protéolyse chez les

archées. Il a également apporté des informations sur la dynamique du complexe créée par la liaison du nucléotide (ATPγS). Bien que l’enveloppe Cryo-EM et le modèle pseudo-atomique présentés fournissent des informations précieuses sur la structure et les mécanismes fonctionnels du complexe PAN libre, ces modèles représentent des conformations spécifiques et statiques en raison des conditions expérimentales de la microcopie électronique.

Les unfoldases AAA+ régulateurs des systèmes protéolytiques et les chaperonnes de désassemblage détruisent leurs protéines substrats via des mécanismes très dynamiques et soigneusement contrôlés. Des changements de conformation dans le complexe, alimentés par

la liaison et l’hydrolyse de l’ATP créent une force de dépliement mécanique nécessaire pour

tirer et déplier la protéine substrat attachée avant sa translocation dans la particule catalytique. Les modules AAA+ ATPases des particules régulatrices sont les moteurs qui animent les procédés mécaniques de dénaturation, de désassemblage et de translocation. Dans les

machines AAA+, les cycles de liaison d’ATP, d’hydrolyse et de libération d’ADP/Pi

entrainent des cycles de changements conformationnels dans l’enzyme (Sauer et al, 2004).

Des protéines très stables, celles pour lesquelles le dépliement spontané peut prendre des mois, voire des années, sont dépliées en quelques minutes ou moins par la réaction enzymatique (Weber-Ban et al, 1999) (Kenniston et al, 2003). Certaines enzymes AAA+ génèrent des plus grandes forces de dénaturation et sont donc plus puissantes que d’autres en

termes de dépliement des substrats protéiques. Il y a un grand progrès dans la compréhension des rôles et des mécanismes biologiques des AAA+ ATPases impliqués dans la dégradation et le dépliement des protéines. Ce progrès dépend de la disponibilité des informations sur les conformations tridimensionnelles de ces enzymes ainsi que sur la découverte et la caractérisation de nouveaux substrats bien adaptés pour les conditions expérimentales. Malgré tous ces progrès, de nombreuses questions importantes, tant au niveau structurale et

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dynamique, restent sans réponses. En effet, les techniques structurales classiques utilisées

précédemment pour l’étude des AAA+ unfoldases restent limitées en termes d’informations

dynamiques. Souvent seulement un « snapshot » statique d’un complexe protéique est

visualisé malgré le fait que les changements de conformation sont souvent à la base des fonctions biologiques, comme est le cas des moteurs moléculaires AAA+ unfoldase. Les études biophysiques et structurales en temps réel pendant l’action des machines AAA+

unfoldases dans le dépliement des substrats protéiques sont toujours inexistantes et les

changements de conformation de ces machines moléculaires à l’échelle de quelques secondes

est un domaine d’étude important.

Afin de mieux comprendre la dynamique et les changements conformationnels du complexe PAN et de son substrat modèle la GFPssrA en temps réel en solution pendant le processus de dépliement ATP-dépendant nous avons mis au point et utilisé la diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) avec de la deutération et la variation de contraste entre le complexe PAN et son substrat, couplée à la fluorescence en ligne (Fig. 37, chapitre 2.3). Cette étude nous a permis de suivre le processus de dépliement en focalisant séparément sur un des deux partenaires du système. En un premier temps des courbes SANS ont été enregistrées sur la GFPssrA deutérée pendant son dépliement par PAN, ensuite les changements de

conformations de PAN ont été également suivis en temps réel pendant l’activité enzymatique. Ce projet porte également un aspect méthodologique vu le court temps d’exposition de 30

secondes utilisé pour le collecte des données SANS qui permet de suivre en temps réel le processus de dépliement ainsi que le couplage avec les mesures de la fluorescence en ligne sur

la GFPssrA pendant l’activité enzymatique. La totalité des résultats obtenus ont apporté

plusieurs informations précieuses sur le mécanisme fonctionnel du système PAN pendant le

dépliement des substrats protéiques ainsi que sur le mode d’action des AAA+ unfoldases

impliqués dans la régulation des systèmes protéolytiques. Nos résultats ont également validé

l’applicabilité et la faisabilité du SANS en temps réel pour étudier des processus biologiques

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5.2.2 Small angle neutron scattering reveals protein substrate