Purification et hexamérisation

Les bactéries resuspendues dans du tampon de lyse (20 mM Tris/HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) sont lysées par cinq cycles de sonication (40 s ON / 40 s OFF) à l’aide d’une sonde à 100%

d’activité (Branson Sonifer® 150) après ajout (dans le cas des protéines PAN) du lysozyme,

DNaseI, MgSO4, Pefabloc, RNase, une tablette de ‘complete’ (Protease Inhibitor Cocktail Tablets) et du triton X-100. Vu que les protéines PAN sont isolées des organismes hyperthermophiles Pyrococcus horikoschii et Methanococcus jannaschii, elles sont plus thermostables que les protéines d’E. coli et fonctionnent de manière optimale à haute température. Pour cela un choc thermique de 15 minutes à 85 °C est effectué sur les cellules après la lyse comme une étape de purification supplémentaire. Ce traitement permet

d’éliminer le maximum de protéines d’E. coli non thermostables à cette température. La

solution est ensuite centrifugée à 12 000 rpm pendant 1 heure (PAN) ou 20 min à 14 000 rpm (GFPssrA) dans un rotor Beckman JA20.

Purification de PhPAN :

Le surnageant est déposé sur une colonne DEAE échangeuse d’anion faible (volume VC = 20

ml), équilibrée avec du tampon 20 mM Tris/HCl pH 8, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl et 1 mM DTT à un débit de 2 ml/min. Elle est lavée avec le même tampon après fixation de la

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protéine puis les protéines sont éluées avec un gradient de chlorure de sodium (NaCl) allant

de 150 mM jusqu’à 500 mM. La protéine sort à une concentration de NaCl de 300 mM, les

fractions contenant la protéine sont rassemblées. La solution protéique est ensuite diluée avec le même tampon jusqu'à une concentration finale de 150 mM de NaCl et déposée de nouveau

sur une colonne MonoQ 5/50 GL échangeuse d’anion forte (GE Healthcare) (VC = 1 ml) à un

débit de 1 ml/min équilibrée et lavée dans le même tampon contenant 150 mM NaCl. La

protéine est ensuite éluée avec un gradient de 150 mM jusqu’à 500 mM NaCl. Les fractions

contenant la protéine sont congelées à -20 °C ou déposées immédiatement sur une colonne de gel filtration. Après concentration de la solution de PhPAN par un Centricon® de cut-off 50 kDa, la protéine est alors déposée par injection de 500 µl sur une colonne de gel filtration Superose 6 10/300 GL (GE Healthcare) équilibrée avec le même tampon (20 mM Tris/HCl pH 8, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl et 1 mM DTT) au débit de 0,5 ml/min. Les fractions contenant la PhPAN sont réunies, concentrées et stockées à -20 °C pour des utilisations ultérieures.

Purification de MjPAN :

Après la lyse des cellules et la centrifugation, le surnageant est déposé sur une colonne de Nickel (HiTrap Chelating HP, GE Healthcare) (VC = 5 ml) équilibrée avec du tampon contenant 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl et 5 mM imidazole. La colonne est lavée avec le même tampon contenant 50 mM puis 100 mM imidazole (10

volumes colonne chaque lavage). La protéine est éluée dans 20 ml de tampon d’élution

contenant 500 mM imidazole. Après une dialyse pendant la nuit contre un tampon ne contenant pas d’imidazole, la protéine est ensuite purifiée sur une colonne MonoQ 5/50 GL

échangeuse d’anion puis une colonne Superose 6 10/300 GL d’exclusion de taille comme

décrit pour PhPAN. Les fractions contenant la MjPAN sont réunies, concentrées et stockées à -20 °C pour des utilisations ultérieures.

Comme déjà mentionné dans le chapitre « Introduction », le complexe d’activation du

protéasome PAN est actif sous sa forme héxamérique. Dans nos conditions de purification les deux complexes PAN de P. horikoschii et M. janaschiisont purifiés sous forme d’un équilibre

dodécamère/héxamère. Pour obtenir uniquement la forme hexamère des complexes PAN et une solution homogène et monodisperse de la protéine nécessaire pour nos études biochimiques et structurales, en particulier la microscopie électronique et le SAXS/SANS, la solution protéique est chauffée après la dernière colonne de gel filtration pendant 30 min à 60 °C en présence de 4 mM ATP et 10 mM MgCl2 déjà présent dans le tampon d’élution. La

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protéine est chargée de nouveau sur colonne Superose 6 10/300 GL sans ATP dans le tampon

et l’état d’oligomérisation final est vérifié via le profil d’élution (chromatogramme) et par

microscopie électronique en coloration négative.

Purification de la GFPssrA :

100 mM du triéthanolamine base (TEA base) avec 40% (w/v) de sulfate d’ammonium

(NH4)2SO4 sont ajoutés au surnageant obtenu après la lyse et la centrifugation des cellules (comme expliqué ci-dessus). Après incubation d’une heure à 4 °C, les protéines précipitées

sont éliminées par centrifugation à 4 °C pendant 20 min à 6 000 rpm dans un rotor JA20 (Beckman J2-MC Centrifuge). 20% (w/v) du (NH4)2SO4 est ensuite ajouté au surnageant. Une

première extraction à l’éthanol est réalisée. Pour cela 1/4 de volume d’éthanol (Fluka, ≥

99,8%) est ajouté. La solution est secouée vigoureusement pendant une minute. Les deux phases sont séparées par centrifugation 10 min à 4 500 rpm (Beckman Coulter Alegarx®-30R Centrifuge). La phase organique (du dessus) contenant la GFPssrA est récupérée. 1/16 de

volume d’éthanol est ensuite ajouté. La solution est de nouveau secouée vigoureusement

pendant une minute et centrifugée de nouveau 10 min à 4 500 rpm (Beckman Coulter Alegarx®-30R-Centrifuge). La phase organique est récupérée, avec laquelle on effectue une seconde extraction au butan-1-ol. Pour cela 1/4 de volume de butan-1-ol est ajouté. La solution est secouée vigoureusement 30 s et centrifugée 10 min à 4 500 rpm (Beckman Coulter Alegarx®-30R-Centrifuge). A cette étape, la GFPssrA est dans la phase aqueuse (du dessous), qui est récupérée. Un volume équivalent de chloroforme est ajouté. La solution est secouée vigoureusement 30 s et centrifugée 10 min à 4 500 rpm (Beckman Coulter Alegarx®-30R-Centrifuge). La phase aqueuse contenant la GFPssrA est récupérée, et 20% (w/v) du (NH4)2SO4 y est ajouté. La solution protéique contenant la GFPssrA soluble est déposé sur une colonne Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) (VC ~ 18 ml) équilibrée avec un tampon 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 20% (w/v) (NH4)2SO4 à un débit de 1 ml/min. Elle est lavée avec le même tampon (3 volumes colonne) puis les protéines sont éluées avec du 20 mM Tris/HCl pH 7,5 sans (NH4)2SO4. Les fractions contenant les protéines sont rassemblées et congelées à -20 °C.

La colonne Phenyl Sepharose (GE Healthcare) à forte concentration en sulfate d’ammonium,

fixe les protéines par précipitation non dénaturante sur le support (chromatographie

d’adsorption). Les protéines se fixent au gel par des liaisons hydrogènes, des liaisons de van

der Waals ou hydrophobes. La baisse de la concentration en sulfate d’ammonium permet de

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Expression et purification des protéines deutérées

La deutération des molécules biologiques implique la croissance d’une culture bactérienne (le

plus souvent E. coli) dans de l’eau lourde (D2O) supplémenté avec des sources de carbone deutérées ou hydrogénées, en fonction du niveau de deutération requis. La biomasse est ensuite récoltée et la molécule deutérée est purifiée et caractérisée.

La deutération permet l’utilisation des techniques biophysiques basées sur les neutrons

comme la diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) pour l’étude de la relation structure

-fonction des protéines, ADN, ARN ou d’autres molécules biologiques. L’hydrogène est un

élément majeur et essentiel dans la composition des molécules biologiques y compris les

protéines. Comme les neutrons interagissent différemment avec les atomes d’hydrogène ou de

deutérium, le contraste entre une protéine hydrogénée et une protéine deutérée est suffisant pour séparer les deux contributions et donc les techniques de diffusion de neutrons sont très

utiles pour l’étude des macromolécules biologiques surtout dans le cas de complexes

protéine-protéine (voir paragraphe 2.2). Les échantillons dPAN (MjPAN) et dGFPssrA (d = deutéré)

ont été produits avec l’aide de Martine Moulin et Michael Härtlein au sein du laboratoire de

deutération de l’ILL, le D-LAB.