Réducteur Eu-DTPA à pH 7

Le complexe Eu-DTPA, avec un potentiel à pH 8 de -1.14V par rapport à l’électrode normale à hydrogène, est l’agent le plus réducteur parmi ceux que nous avons sélectionnés. Il nous permet donc d’étudier l’activité catalytique des complexes et des hybrides dans les conditions les plus réductrices. Nous avons utilisé ce réducteur ainsi que les deux cobaloximes [Co(dmgH)2(H2O)2] et [Co(dmgBF2)2(H2O)2] afin de mettre au point les conditions de catalyse.

Dans un premier temps nous avons donc étudié la production d’hydrogène sans agitation dans la cuve ce qui d’un côté permet d’éviter au maximum le passage de l’hydrogène gazeux formé lors de la réaction dans la phase gazeuse au-dessus de la solution. Cependant, d’un autre côté, cela limite la cinétique de l’activité catalytique parce que le réducteur doit diffuser dans la solution. On mesure alors une production lente d’hydrogène pour les deux complexes avec un maximum de la concentration en hydrogène atteinte après environ 80 min pour

[Co(dmgH)2(H2O)2] avec 2.8 cycles catalytiques (en bleu figure 166) et 50 min pour

[Co(dmgBF2)2(H2O)2] avec 1.8 cycles catalytiques (en orange figure 166).

Figure 166. Cycles catalytiques en hydrogène (TON) en fonction du temps (min) pour [Co(dmgH)2(H2O)2] (bleu) et [Co(dmgBF2)2(H2O)2] (orange) avec ajout d’Eu-DTPA (10 équivalents) en tampon Tris/HCl 50 mM à pH 7.

La réaction est encore plus lente avec les hybrides puisque, par exemple, le maximum, correspondant à un cycle catalytique, est atteint en 90 min avec l’hybride Mb-[Co(dmgBF2)2(H2O)2] comme catalyseur. Aucune trace d’hydrogène n’a été mesurée en

présence d’uniquement un sel de cobalt(II) (chlorure de cobalt hexahydrate) ce qui nous permet de confirmer que, dans ces conditions, les cobaloximes sont bien à l’origine de la catalyse de production d’hydrogène.

Nous avons également mesuré l’activité catalytique des deux cobaloximes avec une agitation douce permettant à la fois d’homogénéiser la solution après ajout du réducteur et d’éliminer les bulles se formant inévitablement lors de la réaction. Nous avons dans un premier temps vérifié que dans ces conditions la mesure de la concentration d’une solution d’hydrogène saturée à 40% (correspondant à une concentration en hydrogène dissous de 320 µM) est stable pendant au moins 30 min ce qui nous permet de valider notre méthode de travail ainsi que de connaitre les limites en concentration et en temps à ne pas dépasser pour obtenir des résultats cohérents. En agitant la solution tout au long de la mesure, la cinétique est très significativement accélérée puisqu’on atteint alors le maximum de la concentration en hydrogène en 5 min pour [Co(dmgH)2(H2O)2] avec 2.2 cycles catalytiques, en environ 1 min pour [Co(dmgBF2)2(H2O)2]

d’hydrogène formée (TON) n’est quand-à-elle pas affectée de manière importante par l’agitation.

Figure 167. Cycles catalytiques en hydrogène (TON) en fonction du temps (min) pour [Co(dmgH)2(H2O)2] (bleu) et [Co(dmgBF2)2(H2O)2] (orange) et [Co{(DO)(DOH)pn}Cl2] (rouge) avec ajout d’Eu-DTPA (10 équivalents) en tampon Tris/HCl 50 mM à pH 7.

Les différences observées entre les profils des courbes de concentration d’hydrogène en fonction du temps obtenues pour les différents complexes s’expliquent par des différences cinétiques pouvant être liées à des différences mécanistiques mais nous n’avons pas poussé plus loin cette étude. Nous nous sommes donc intéressés uniquement à l’activité catalytique globale du système (nombre maximum de cycles catalytiques effectués). Comme on peut le voir sur la figure 167 [Co(dmgH)2(H2O)2] réalise 2.2 cycles catalytiques,

[Co(dmgBF2)2(H2O)2] en réalise 1.8 et [Co{(DO)(DOH)pn}Cl2] n’effectue qu’ 1.1 cycles. Ces

résultats prouvent qu’il y a bien formation d’hydrogène en milieux aqueux à pH 7 en présence de ces complexes de cobalt. La comparaison de ces résultats avec ceux obtenus pour les hybrides nous permettent de plus d’étudier spécifiquement l’influence de l’enveloppe protéique sur l’activité catalytique des complexes. Nous avons ainsi pu mesurer l’activité de production d’hydrogène des deux cobaloximes en présence de myoglobine ou d’hème oxygénase 1 de rat. Comme on peut le voir sur la figure 168 alors qu’on observe une légère diminution de l’activité catalytique de la cobaloxime [Co(dmgH)2(H2O)2] en présence de myoglobine (1.2 cycles

catalytiques), l’activité est légèrement améliorée en présence d’hème oxygénase puisqu’on obtient alors 3 cycles catalytiques.

Figure 168. Cycles catalytique en hydrogène (TON) en fonction du temps (min) pour [Co(dmgH)2(H2O)2] (bleu), Mb- [Co(dmgH)2(H2O)2] (orange) et HO1-[Co(dmgH)2(H2O)2] (rouge) avec ajout d’Eu-DTPA (10 équivalents) en tampon Tris/HCl 50 mM à pH 7.

Pour le cas de la cobaloxime [Co(dmgBF2)2(H2O)2] on obtient environ 0.8 cycle catalytique

que ce soit en présence de myoglobine ou en présence d’hème oxygénase ce qui est juste légèrement inférieur au cycle catalytique fait par la cobaloxime seule en solution.

Figure 169. Cycles catalytique en hydrogène (TON) en fonction du temps (min) pour [Co(dmgBF2)2(H2O)2] (bleu), Mb- [Co(dmgBF2)2(H2O)2] (orange) et HO1-[Co(dmgBF2)2(H2O)2] (rouge) avec ajout d’Eu-DTPA (10 équivalents) en tampon Tris/HCl 50 mM à pH 7.

L’hybride Mb-[Co{(DO)(DOH)pn}Cl2] a donné des résultats similaires (0.7 cycles

Figure 170. Cycles catalytique en hydrogène (TON) en fonction du temps (min) pour Mb-[Co{(DO)(DOH)pn}Cl2] avec ajout d’Eu-DTPA (10 équivalents) en tampon Tris/HCl 50mM à pH 7.

Ces études préliminaires nous ont permis de confirmer la production d’hydrogène en milieu aqueux à pH 7 que ce soit par les complexes de cobalt seuls ou par les espèces hybrides. Nous avons pu mettre au point un protocole permettant de mesurer le nombre total de cycles catalytiques obtenus. Du fait de la grande sensibilité de la sonde à hydrogène les mesures intéressantes ont été répétées au moins 3 fois et nous avons pu observer des écarts de mesures pouvant aller jusqu’à 38% dans certaines conditions. Cependant il est important de noter que pour les valeurs les plus intéressantes et les plus pertinentes (c’est-à-dire avec une activité catalytique meilleure en présence de protéine ou avec une activité catalytique significative d’une dizaine de cycles) les expériences ont été répétées un nombre de fois suffisant pour obtenir des écarts plus faibles (jusqu’à 20%, incertitude classique du dosage protéique).

Nous avons mesuré l’activité catalytique des trois complexes de cobalt ainsi que celle de certains hybrides à différentes concentrations (91 µM, 71 µM et 40 µM) et nous avons obtenu dans toutes les conditions des résultats similaires. Cela nous prouve qu’avec ce type de réducteur l’activité catalytique est indépendante de la concentration en cobalt.

Une fois la concentration en hydrogène stabilisée nous avons pu relancer la réaction en ajoutant à nouveaux 10 équivalents de complexe d’europium comme on peut le voir sur la figure 171 dans le cas du complexe [Co{(DO)(DOH)pn}Cl2].

Figure 171. Cycles catalytique en hydrogène (TON) en fonction du temps (min) pour [Co{(DO)(DOH)pn}Cl2] et Mb- [Co{(DO)(DOH)pn}Cl2] avec ajout de 10 équivalents d’Eu-DTPA à 0 min puis à 3.4 min et 2.8 min respectivement en tampon Tris/HCl 50mM à pH 7.

Cela montre que dans nos conditions d’étude, à la fois pour les complexes seuls en solution et pour les hybrides, la réaction cesse à cause de la dégradation du réducteur (peut-être du fait d’une instabilité en milieux aqueux). Ainsi, l’ajout initial d’une quantité double d’europium ne nous a pas permis d’augmenter la quantité finale d’hydrogène produit comme on peut le voir sur la figure 172 dans le cas de [Co(dmgH)2(H2O)2].

Figure 172. Cycles catalytique de production d’hydrogène en fonction du temps (min) pour [Co(dmgH)2(H2O)2] avec ajout de 10 équivalents d’ Eu-DTPA (jaune) et de 20 équivalents (rouge) en tampon Tris/HCl 50mM à pH 7.

Le complexe [Co{(DO)(DOH)pn}Cl2], ayant montré l’activité catalytique la plus faible en

solution, n’a pas été étudié par la suite dans les autres conditions, l’idée étant de tester son activité catalytique une fois les conditions expérimentales optimales trouvées pour les différents hybrides. Nous présenterons donc dans la suite les résultats obtenus pour les deux cobaloximes ainsi que pour certains hybrides de ces complexes avec des protéines.