Influence de l’enveloppe protéique

Enfin la nature de l’enveloppe protéique influence également l’activité catalytique de l’hybride et particulièrement dans le cas de l’insertion de la cobaloxime [Co(dmgH)2(H2O)2] qui a

montré les meilleurs résultats. Quelles que soient les conditions de catalyse utilisées, les hybrides basés sur la myoglobine ont montré une activité catalytique plus faible que ceux basés sur les hème oxygénases. Malgré la grande similarité des structures primaire, secondaire et tertiaire de l’hème oxygénase 1 de rat (HO1) et de l’hème oxygénase de Corynebacterium

diphteriae (HmuO), les hybrides formés avec ces deux protéines et la cobaloxime ont montré

des activités catalytiques différentes. Ainsi en réduction avec le complexe Eu-EGTA, l’activité catalytique de HO1-[Co(dmgH)2(H2O)2] est légèrement supérieure à celle de

HmuO-[Co(dmgH)2(H2O)2] (6 cycles catalytiques contre 5). Dans ces conditions l’activité

catalytique des hybrides basés sur l’hème oxygénase est plus de deux fois supérieure à celle du complexe libre en solution. La différence est beaucoup plus marquée en condition de photocatalyse avec la déazaflavine. En effet dans ces conditions l’hybride HmuO-[Co(dmgH)2(H2O)2] a montré une activité catalytique 2.5 fois plus grande que l’hybride

HO1-[Co(dmgH)2(H2O)2]. Il s’agit de la meilleure activité catalytique mesurée pour les

hydrogénases artificielles étudiées lors de cette thèse.

4. Conclusion

Il ressort de ces études que l’enveloppe protéique (même avec uniquement de légères différences comme pour HO1 et HmuO) influence l’activité catalytique du complexe de cobalt.

Cette influence est dépendante de la nature du complexe ainsi que du réducteur mis en jeu dans la catalyse. Les hybrides basés sur l’hème oxygénase ont montré les meilleures activités catalytiques. Cela peut s’expliquer par le fait que biologiquement il s’agit d’une protéine impliquée dans des réactions d’oxydoréduction lors de la catalyse de dégradation de l’hème en billiverdine et donc dont la structure est plus adaptée aux échanges électroniques entre le cofacteur et un partenaire. Nous pouvons trouver cependant dans la littérature ou dans la nature l’existence de transferts électroniques entre la myoglobine et des partenaires extérieurs. En effet la met-myoglobine incorporant l’hème à l’état ferrique interagit par exemple en milieux biologique avec le cytochrome b5.210 Ce complexe enzymatique est impliqué dans la réduction de l’hème. Le groupe d’Hayashi en 1998211

a également montré qu’il est possible d’avoir un transfert électronique entre une porphyrine de fer modifiée insérée dans la myoglobine et le cytochrome c natif.

Dans tous les cas nous avons pu montrer au travers de cette étude que les hybrides préparés sont actifs pour la production d’hydrogène. L’optimisation des conditions d’étude ainsi que du couple protéine/complexe de cobalt nécessite une étude détaillée de l’influence de tous les paramètres, ce que nous n’avons pu terminer par faute de temps. Cependant nous avons pu identifier des conditions optimales d’études : ajout lent de réducteur Eu-EGTA et photoréduction par la déazaflavine pour la cobaloxime [Co(dmgH)2(H2O)2] et les hybrides

associés, photoréduction par le Ru pour la cobaloxime [Co(dmgBF2)2(H2O)2] et les hybrides

associés. Nous avons pu également identifier des conditions de catalyse pour lesquelles la présence de la protéine améliore l’activité du complexe. En effet l’hybride HO1-[Co(dmgH)2(H2O)2] a montré une activité 2.5 fois supérieure à la cobaloxime

[Co(dmgH)2(H2O)2] en présence de réducteur Eu-EGTA.

Nos investigations nous ont permis d’obtenir dans les meilleurs conditions des activités catalytiques raisonnables pour des tests catalytiques en milieu uniquement aqueux et à pH neutre. En effet, les seuls résultats de la littérature concernant une hydrogénase artificielle obtenue de manière similaire c’est-à-dire avec un site catalytique situé dans une enveloppe protéique sont ceux du groupe d’Hayashi avec l’incorporation de complexes dinucléaire de fer dans le cytochrome c. Ce système effectue 5.6 cycles catalytiques dans des conditions photocatalytiques avec [Ru(bipy)3]Cl2 comme photosensibilisateur et l’ascorbate comme

donneur d’électrons sacrificiel. Nos investigations ont permis d’obtenir, dans les meilleurs conditions, des activités catalytiques bien meilleures avec jusqu’à 15 cycles catalytiques pour l’hybride HmuO-[Co(dmgH)

CONCLUSION

ET

Conclusion et Perspectives

L’objectif de ce travail de thèse était la préparation, la caractérisation et l’étude de l’activité catalytique d’enzymes artificielles actives en solution aqueuse pour la production d’hydrogène.

Dans un premier temps nous avons mis au point une méthode générale permettant de préparer des systèmes hybrides basés sur des hémoprotéines et des complexes de cobalt, connus pour être de bons catalyseurs pour la réduction de protons en milieu organique. Nous avons ainsi préparé différents systèmes hybrides à partir principalement de myoglobine de cachalot et d’hème oxygénase 1 de rat. Les catalyseurs inorganiques utilisés sont des cobaloximes ([Co(dmgH)2(H2O)2] et [Co(dmgBF2)2(H2O)2]) ainsi qu’un complexe diimine

dioxime de cobalt [Co{(DO)(DOH)pn}Cl2].

Dans un second temps, nous avons caractérisé ces différents hybrides par plusieurs méthodes spectroscopiques et effectué leur modélisation par mécanique moléculaire. Nous avons ainsi montré que l’histidine fixant naturellement l’hème dans l’holo-hème oxygénase et dans l’holo-myoglobine se coordine également au centre cobalt des complexes introduits. Les hybrides basés sur la myoglobine de cachalot se sont montrés stables sans dissociation du complexe à faible concentration (10 µM). Néamoins les complexes sont plus sensibles à l’oxydation lorsqu’ils sont incorporés au sein de l’enveloppe protéique.

Dans le cas de la cobaloxime [Co(dmgBF2)2(H2O)2], des études en résonance paramagnétique

électronique nous ont permis de qualifier l’environnement du complexe dans la protéine. Ainsi dans la myoglobine le complexe est dans un environnement très hydrophobe. Dans le cas de l’hème oxygénase on observe la formation de deux espèces quel que soit le complexe incorporé dans la protéine. Ces deux espèces ont des environnements différents. La première espèce a un environnement très ouvert sur le milieu extérieur alors que la deuxième possède un environnement très hydrophobe, semblable à celui procuré au sein de la myoglobine.

Dans un troisième temps, nous avons préparé des électrodes modifiées permettant d’étudier les propriétés électrochimiques des hybrides basés sur la myoglobine grâce à leur affinité avec les nanotubes de carbone. Les potentiels électrochimiques du couple Co(II)/Co(I) des complexes de cobalt sont affectés par l’environnement protéique. Ces caractéristiques ont pu être mises en relation avec les propriétés catalytiques des hybrides.

L’activité des hybrides formés pour la production d’hydrogène a été évaluée dans différentes conditions de catalyse et de photocatalyse. Tous les hybrides formés ont montré une activité catalytique et il ressort de cette étude que l’activité des hybrides est fortement dépendante du milieu (notamment son pH) mais également du réducteur utilisé. Ainsi dans les meilleures conditions nous avons pu obtenir jusqu’à 15 cycles catalytiques pour l’hybride HmuO-[Co(dmgH)2(H2O)2] (HmuO étant l’hème oxygénase de la bactérie Corynebacterium diphteria). Dans certains cas également l’environnement protéique a permis d’augmenter

l’activité catalytique du complexe (d’un facteur 2.5 par exemple dans le cas de l’hybride HO1-[Co(dmgH)2(H2O)2]) par rapport à celle observée pour le complexe seul en solution.

Ces premiers résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour la caractérisation et l’étude fonctionnelle d’enzymes artificielles basées sur une hémoprotéine et des complexes de cobalt. Tout l’enjeu est de trouver le bon couple protéine-catalyseur inorganique permettant d’obtenir une hydrogénase artificielle avec la meilleure propriété catalytique. Dans ce cadre l’étude d’autres hémoprotéines (comme par exemple FixL sur qui nous avons commencé des travaux préliminaires) comme protéine hôte ou la mutation de certains acides aminés sont à prévoir. L’identification des acides aminés pouvant influencer l’activité catalytique de l’enzyme artificielle pourra être faite grâce à des études de modélisation au niveau QM/MM. La formation des hybrides avec la myoglobine étant un processus irréversible il pourrait également être intéressant d’étudier l’interaction de la myoglobine avec des complexes de cobalt immobilisés au préalable sur électrodes. En outre on peut envisager de produire des enzymes artificielles incorporant à la fois l’activité catalytique et celle d’absorption de lumière. Le photosystème I (PSI) a en effet été fonctionnalisé par le groupe de J. Golbeck avec une hydrogénase.212-214 On peut donc imaginer fonctionnaliser le photosystème I avec les complexes de cobalt. Une fois cette fonctionnalisation effectuée il sera alors possible d’incuber l’hybride PSI-complexe de cobalt avec la myoglobine avec d’obtenir un système protéique hybride photosensibiliateur-catalyseur.