Récepteurs purinergiques

Les récepteurs purinergiques P2Y2 et P2X7 sont également connus pour stimuler le clivage en ! de l’APP (271 , 272).

4.3.1.4.2.1 Le récepteur P2Y2

Le récepteur P2Y2 est un récepteur à 7 passages transmembranaires couplé à une protéine Gq. Ce récepteur peut être stimulé aussi bien par l’ATP que l’uridine 5’ triphosphate (UTP). Camden et coll. ont montré qu’après transfection de l’astrocytome humain 1321 N1 par l’ADN codant le récepteur P2Y2 humain, la stimulation de ce récepteur entraînait la libération

!

93! du fragment soluble sAPP# (271). Ils ont établi par ARN interférent, que l’activation du P2Y2 aboutissait à la stimulation d’une activité sécrétase-# qui serait due aux enzymes ADAM10 et 17. Par la suite, le même groupe a démontré que la stimulation par l’IL-1! de neurones primaires de cortex de rat entraînait une sur-expression du récepteur P2Y2 qui après activation par l’UTP provoquait une libération de sAPP# par une voie biochimique mettant en jeu les métalloprotéases ADAM10 et 17 (273). Ainsi dans ce modèle, les auteurs montrent qu’une cytokine pro-inflammatoire comme l’IL-1! est capable de stimuler l’expression du récepteur P2Y2 sur des neurones corticaux et de favoriser le clivage non-amyloïdogénique de l’APP.

4.3.1.4.2.2 Le récepteur P2X7

Au sein du laboratoire, le Dr Delarasse a démontré que l’activation du P2X7R par l’ATP ou le Bz-ATP provoque une coupure protéolytique de l’APP et libère le fragment neuroprotecteur sAPP#. Ce résultat a été obtenu dans plusieurs lignées cellulaires : les cellules neurales progénitrices (NPCs), les cellules de neuroblastomes murin (Neuro-2a) ou humain (SK-N-BE) et les astrocytes primaires de souris. En effet, ils ont démontré que la coupure est dépendante du P2X7R par trois stratégies. (1) en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques sélectifs de P2X7R tels que A-438079 et l’o-ATP, (2) à l’aide d’ARN interférents spécifiques de P2X7R, (3) grâce à des cultures primaires d’astrocytes et de cellules neurales progénitrices invalidées pour le récepteur P2X7 (Figure 25).

Figure 25 : La stimulation du récepteur P2X7 par le Bz ATP aboutit à la libération du fragment soluble sAPP".

Analyse des surnageants et des lysats de culture primaire d’astrocytes et de cellules neurales progénitrices wild-type ou invalidée pour le récepteur P2X7 (272).

L’étude préliminaire de la voie biochimique a montré que la coupure protéolytique de l’APP, induite par P2X7R, est due à une métalloprotéase différente des ADAM9, 10 et 17 (272).

activation, which is characteristic of P2X7R. These results show that ATP or Bz-ATP treatment induces the release of the soluble fragment of APP (sAPP), suggesting that P2X7R is involved in this phenomenon.

Bz-ATP Treatment Induces the Release of the sAPP-! Fragment—Two soluble forms of APP have been described that result from the proteolytic cleavage of APP by two sectases: ! or " (1, 2). To determine which APP fragment is re-leased following Bz-ATP stimulation, we used two mAbs: one reacting with the APP N-terminal region (mAb 22C11) and one which only recognizes the sAPP! fragment (mAb 6E10). As shown in Fig. 2E, both antibodies react with sAPP in the supernatant from Neuro2a-hAPP cells treated with Bz-ATP, demonstrating that Bz-ATP stimulation induces an !-cleav-age of APP (Fig. 2E). To determine whether P2X7R activation also affects the "-secretase cleavage of APP, we compared the amounts of sAPP! and sAPP" fragments using specific ELISA. As expected, we found a 3-fold increase of sAPP! in the supernatant of Bz-ATP-stimulated Neuro2a-hAPP cells as compared with controls (Fig. 2F) (specific increase in sAPP! released ! 28 " 9 ng/ml, n ! 3 independent experiments). In

stimulated or not with Bz-ATP i.e. the levels of sAPP" were below the detection threshold 0.4 ng/ml. In addition, the amount of APP remained constant in cell lysates of stimulated or control cells (120 " 18 ng/ml for 105Bz-ATP-stimulated Neuro2a cells versus 120 ng/ml " 10 ng/ml for 105control Neuro2a cells) while sAPP" decreased significantly in lysates of Bz-ATP-stimulated cells as compared with controls (Fig. 2G). We also titrated the amounts of peptides A"1– 40 and A"1– 42 in supernatants and cell lysates. We did not find these peptides using ELISAs that detect 10 pg/ml of A" pep-tides. In summary, these results show that Bz-ATP stimula-tion triggers the release of sAPP! and simultaneously de-creases the amount of sAPP" suggesting strongly that P2X7R activates the !-secretase pathway predominantly.

Bz-ATP-induced APP Release Is Mediated by the P2X7R— We next used two sets of experiments with pharmacological inhibitors and siRNA to demonstrate that P2X7R stimulation by Bz-ATP triggers the release of sAPP!. Pre-treatment of Neuro2a-hAPP cells with pharmacological inhibitors of P2X7R, BBG, oATP, or the more selective one, A438079 (25, 26), inhibits sAPP! release (Fig. 3, A–C) (n ! 3; p # 0.001 for

FIGURE 3. Bz-ATP stimulation induces sAPP release via activation of P2X7R. Neuro2a-hAPP cells were preincubated at 37 °C for 1 h with 10 #Mand 50 #MBBG (A), for 2 h with 300 #MoATP (B), and for 30 min with 10 #MA438079 (C), and stimulated with or without Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C. Superna-tants were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11). Histograms correspond to the densitometric analysis of sAPP release as described under “Experimental Procedures.” Values are the means " S.E. of at least three independent experiments (one-way ANOVA followed by Tukey Test, F ! 36.3 for BBG and Student’s t test for oATP and A438079, **, p # 0.01; ***, p # 0.001). D, cell lysates of Neuro2a-hAPP cells transfected with control or P2X7R siRNA were analyzed, using anti-P2X7R or anti-actin Abs, by Western blot (representative of four independent experiments). E, Neuro2a-hAPP cells were trans-fected with control or P2X7R siRNA and stimulated with or without Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C. Supernatants were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11). Histograms correspond to the densitometric analysis of sAPP release as described under “Experimental Procedures.” Values are the means " S.E. of four independent experiments (Student’s t test, ***, p # 0.001). F, supernatants and cell lysates from C57BL/6 or P2X7Rko astrocytes stimu-lated without or with Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11) or anti-actin Ab. Blots shown are repre-sentative of four independent experiments. G, supernatants and cell lysates from C57BL/6 or P2X7Rko NPCs stimulated with or without Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11) or anti-actin Ab. Blots shown are representative of three independent

experiments.

P2X7R Induces sAPP! Shedding

at UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11, on October 17, 2012

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activation, which is characteristic of P2X7R. These results show that ATP or Bz-ATP treatment induces the release of the soluble fragment of APP (sAPP), suggesting that P2X7R is involved in this phenomenon.

Bz-ATP Treatment Induces the Release of the sAPP-! Fragment—Two soluble forms of APP have been described that result from the proteolytic cleavage of APP by two sectases: ! or " (1, 2). To determine which APP fragment is re-leased following Bz-ATP stimulation, we used two mAbs: one reacting with the APP N-terminal region (mAb 22C11) and one which only recognizes the sAPP! fragment (mAb 6E10). As shown in Fig. 2E, both antibodies react with sAPP in the supernatant from Neuro2a-hAPP cells treated with Bz-ATP, demonstrating that Bz-ATP stimulation induces an !-cleav-age of APP (Fig. 2E). To determine whether P2X7R activation also affects the "-secretase cleavage of APP, we compared the amounts of sAPP! and sAPP" fragments using specific ELISA. As expected, we found a 3-fold increase of sAPP! in the supernatant of Bz-ATP-stimulated Neuro2a-hAPP cells as compared with controls (Fig. 2F) (specific increase in sAPP! released ! 28 " 9 ng/ml, n ! 3 independent experiments). In contrast, we did not detect sAPP" in the supernatants of cells

stimulated or not with Bz-ATP i.e. the levels of sAPP" were below the detection threshold 0.4 ng/ml. In addition, the amount of APP remained constant in cell lysates of stimulated or control cells (120 " 18 ng/ml for 105Bz-ATP-stimulated Neuro2a cells versus 120 ng/ml " 10 ng/ml for 105control Neuro2a cells) while sAPP" decreased significantly in lysates of Bz-ATP-stimulated cells as compared with controls (Fig. 2G). We also titrated the amounts of peptides A"1– 40 and A"1– 42 in supernatants and cell lysates. We did not find these peptides using ELISAs that detect 10 pg/ml of A" pep-tides. In summary, these results show that Bz-ATP stimula-tion triggers the release of sAPP! and simultaneously de-creases the amount of sAPP" suggesting strongly that P2X7R activates the !-secretase pathway predominantly.

Bz-ATP-induced APP Release Is Mediated by the P2X7R— We next used two sets of experiments with pharmacological inhibitors and siRNA to demonstrate that P2X7R stimulation by Bz-ATP triggers the release of sAPP!. Pre-treatment of Neuro2a-hAPP cells with pharmacological inhibitors of P2X7R, BBG, oATP, or the more selective one, A438079 (25, 26), inhibits sAPP! release (Fig. 3, A–C) (n ! 3; p # 0.001 for BBG; n ! 5; p # 0.001 for oATP and A438079). Transfection

FIGURE 3. Bz-ATP stimulation induces sAPP release via activation of P2X7R. Neuro2a-hAPP cells were preincubated at 37 °C for 1 h with 10 #Mand 50 #MBBG (A), for 2 h with 300 #MoATP (B), and for 30 min with 10 #MA438079 (C), and stimulated with or without Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C. Superna-tants were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11). Histograms correspond to the densitometric analysis of sAPP release as described under “Experimental Procedures.” Values are the means " S.E. of at least three independent experiments (one-way ANOVA followed by Tukey Test, F ! 36.3 for BBG and Student’s t test for oATP and A438079, **, p # 0.01; ***, p # 0.001). D, cell lysates of Neuro2a-hAPP cells transfected with control or P2X7R siRNA were analyzed, using anti-P2X7R or anti-actin Abs, by Western blot (representative of four independent experiments). E, Neuro2a-hAPP cells were trans-fected with control or P2X7R siRNA and stimulated with or without Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C. Supernatants were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11). Histograms correspond to the densitometric analysis of sAPP release as described under “Experimental Procedures.” Values are the means " S.E. of four independent experiments (Student’s t test, ***, p # 0.001). F, supernatants and cell lysates from C57BL/6 or P2X7Rko astrocytes stimu-lated without or with Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11) or anti-actin Ab. Blots shown are repre-sentative of four independent experiments. G, supernatants and cell lysates from C57BL/6 or P2X7Rko NPCs stimulated with or without Bz-ATP (1 mM) for 15 min at 37 °C were analyzed by Western blot using anti-APP mAb (22C11) or anti-actin Ab. Blots shown are representative of three independent

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P2X7R Induces sAPP! Shedding

2600 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 286 • NUMBER 4 • JANUARY 28, 2011

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4.3.2L

Figure 26 : Sites de coupures de l’APP par les sécrétases (", !, # et $). Modifiée de (274).

4.3.2.1 Sécrétase-"

Les sécrétases-! coupent l’APP entre la lysine16 (K) et la leucine17 (L) du peptide a". La coupure en ! s’oppose à la production du peptide toxique (Figure 26).

Trois sécrétases-! appartenant à la famille des métalloprotéases de type ADAM ont été identifiées : ADAM9, ADAM10 et ADAM17 (275, 276) (Cf partie III).

Des études in vivo ont démontré qu’ADAM10 est la principale sécrétase impliquée dans la coupure non amyloïdogénique de l’APP. Dans un modèle murin de MA, la surexpression d’ADAM10 aboutit à une diminution de la charge amyloïde et à une augmentation de la libération du fragment neuroprotecteur sAPP!. A l’inverse, dans ce modèle double transgénique dans lequel ADAM10 n’est plus fonctionnelle, les auteurs ont constaté une augmentation et une formation plus précoce des plaques amyloïdes que chez les contrôles (230). Ainsi, ADAM10 pourrait être une cible thérapeutique potentielle. Cependant, la stimulation de l’activité ADAM pourrait entraîner d’importants effets secondaires au vu des nombreux substrats d’ADAM10 tels que des cytokines pro-inflammatoires comme le TNF! (277) ou la molécule NOTCH. D’autres études ont suggéré qu’ADAM9 pourrait jouer le rôle de sécrétase-! (278 , 279). Cependant, il semblerait qu’ADAM9 soit finalement responsable de l’activation d’ADAM10 (280).

D’autres enzymes de la famille des métalloprotéases pourrait être impliquées dans la coupure

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au site ! de l’APP. L’activation de la voie non amyloïdogénique par le récepteur P2X7 fait intervenir une métalloprotéase différente des ADAM9, 10 et 17 (272).

4.3.2.2 Sécrétase -!

La production du peptide a" est dépendante de la coupure en NH2 terminal de l’APP par une

sécrétase-". En 1999, cinq équipes ont découvert et cloné une aspartyl protéase responsable de la coupure en " de l’APP (281-285). Cette enzyme fortement exprimée dans les neurones (286) a été nommé BACE1 pour Beta site APP Cleaving Enzyme (aussi appelée memapsin-2 ou Asp2). BACE1 est synthétisée sous forme d’un précurseur immature, ProBACE1, qui requiert une glycosylation, une phosphorylation et la coupure du peptide signal par une endopeptidase de type furine afin de produire une enzyme mature (287, 288).

BACE1 coupe l’APP en deux sites distincts : (1) au niveau de l’acide aspartique 1 aboutissant à la libération des peptides amyloïdes majoritaire a"1-40/42 ; (2) ou au niveau du glutamate 11 donnant les peptides a"11-40/42 (286) (Figure 26).

BACE1 a une activité optimale dans un environnement acide. Ainsi, il n’a pas été surprenant d’observer sa forte expression dans le cis/trans golgi et dans les endosomes précoces et tardifs (289, 290). Néanmoins, cette enzyme est également localisée à la surface des cellules.

In vivo, des souris invalidées pour le gène BACE1 semblaient présenter un phénotype

« normal ». En outre, cette déficience entraînait l’abolition quasi complète de la production des peptides toxiques a"40 et 42 suggérant que BACE1 pourrait être une cible thérapeutique (291). Cependant, des études plus récentes ont révélé que ces souris développent une hypomyélinisation des nerfs périphériques (292), attribuée à la diminution de la coupure et de l’activation de la neuréguline, un substrat de BACE1 ainsi que des troubles comportementaux s’apparentant à la schizophrénie (293).

En 2009, une nouvelle sécrétase-" présentant une forte homologie avec BACE1 a été caractérisée. Cette enzyme nommée BACE2 est très peu exprimée au niveau cérébral et n’aurait finalement qu’un rôle mineur dans la production des peptides a" (294).

4.3.2.3 Sécrétase-#

Ces dernières années, des approches biochimiques et génétiques ont permis de caractériser le complexe mutiprotéique sécrétase-$. Dans la forme familiale de la MA, 70% des cas

présentent des mutations de certaines protéines de la sécrétase-$. Ce complexe nécessite quatre protéines pour être fonctionel :

] Préséniline (PS1 ou PS2) compte 8 segments transmembranaires et possède l’activité aspartyl protéase du complexe.

] Nicastrine est une protéine de type I fortement glycosylée, essentielle à l’assemblage du complexe enzymatique.

] Anterior pharynx defective (Aph1) est une protéine à sept passages transmembranaires. Il existe deux gènes homologues Aph1a et Aph1b respectivement localisés sur le chromosome 1 et 15. Aph1 favorise la stabilisation du complexe. ] Préséniline enhancer 2 (Pen2) est une protéine à deux passages transmembranaires qui

est indispensable à l’activation de la préséniline (295).

Au niveau cellulaire, la sécrétase-$ est localisée dans le RE, l’AG, les endosomes et dans la membrane plasmique des cellules. Ce complexe présente la particularité de cliver les substrats dans la portion transmembranaire, c’est à dire dans un environnement hydrophobe.

La sécrétase-$ intervient dans la coupure protéolytique de nombreuses molécules transmembranaires telles que Notch et l’APP. A ce jour, deux sites de coupure par la sécrétase-$ ont été identifiés sur l’APP. Son action catalytique engendre la libération des fragments A"x-40 et AICD59 si la coupure à lieu en position $ ou des peptides A"x-42 et AICD57 pour un clivage au site $’. Les raisons pour lesquelles la sécrétase-$ agit en position $ ou $’ n’ont pas encore été élucidées bien que plusieurs hypothèses aient été proposées. En effet, la coupure en $ ou en $’ pourraient dépendre de la localisation de la sécrétase et plus exactement de l’épaisseur de la membrane dans laquelle celle-ci se situe ou à l’hétérogénéité moléculaire du complexe. En faveur de ces hypothèses, Hartmann et Coll. ont observé dans les neurones que la production a lieu dans le trans-Golgi pour les peptides a"40 et dans le RE pour les peptides a"42 (296). Plus récemment, Serneels et Coll. ont démontré l’importance du type de molécule Aph1 constituant le complexe. L’inactivation spécifique des complexes sécrétase-$ contenant la molécule Aph1a affecte la coupure de l’APP et de Notch (297) tandis que l’invalidation de la protéine Aph1b diminue la libération des peptides a" sans altérer les fonctions de Notch dans un modèle murin de la MA (298).

4.3.2.4 Sécrétase-$

Un nouveau site de clivage situé en aval des sites de la sécrétase-$ a été décrit. Cette coupure a lieu également dans la portion membranaire et libère les fragments a"50 et AICD50. La nature de l’enzyme responsable de cette activité protéolytique est encore très discutée. Cependant, il est fort probable que cette coupure soit due à une activité sécrétase-$ dépendante des présénilines (274, 299 , 300 ).

4.3.3P

’APP

4.3.3.1 Les Peptides amyloïdes