DISCUSSION ET PERSPECTIVES
1.5 Les ERM sont-elles indispensables à la coupure protéolytique de toutes les molécules de surface?
Les résultats que nous avons obtenus et ceux de la littérature internationale nous ont conduit à faire l’hypothèse que les ERM sont indispensables à la coupure protéolytique des récepteurs membranaires qui peuvent être clivés et libérés sous forme soluble dans le milieu extracellulaire. La limitation de notre modèle actuel est due au fait que nous n’avons pas identifié la protéase responsable de la coupure de l’APP après stimulation du P2X7R. Afin de résoudre ce problème, nous nous sommes intéressés au rôle des ERM dans le clivage protéolytique d’autres molécules de surface.
Suite à un crible de molécules de surface coupées après stimulation de P2X7R, nous nous sommes intéressés à la molécule d’adhésion NrCAM qui est impliquée dans la prolifération de certaines lignées tumorales après clivage protéolytique de son ectodomaine (323). Très brièvement, NrCAM (ou Bravo) est une glycoprotéine membranaire de type 1 appartenant à la famille des molécules d’adhérence cellulaire (CAM). Sa partie extracellulaire est constituée de six domaines de type immunoglobuline et de quatre domaines de type fibronectine III qui contient un site de clivage par la furine. Elle est suivie d’une région transmembranaire et d’une partie cytoplasmique de 110 acides aminés. La région cytosolique de NrCAM est composée d’un motif PDZ et d’une séquence RNGGKYPVKE susceptible d’interagir avec le domaine FERM des ERM (Figure 34) (324).
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Figure 34 : Représentation schématique de la molécule d’adhérence NrCAM.
Nous disposons de nombreux mutants de NrCAM, produits par le Dr Faivre Saraillh (UMR
7286 - Centre de Recherche en Neurobiologie et Neurophysiologie de Marseille). Ces
mutants devraient nous permettre de déterminer quelle est la région de NrCAM impliquée dans le clivage protéolytique dépendant des ERM (Figure 35).
Objectif N°1 : Déterminer si les ERM sont indispensables au clivage protéolytique induit par la stimulation du P2X7R et les esters de phorbol.
Afin d’utiliser des modèles cellulaires définis, nous avons produit des clones de transfectants stables du P2X7R à partir de fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris WT, KO pour ADAM10 ou 17 et double KO. Nous projetons d’étudier l’effet de la stimulation du P2X7R dans ces lignées de MEF et déterminerons si les ERM sont indispensables au clivage de tous les ligands, qu’ils soient coupés par ADAM 10 ou 17.
Nous avons déjà montré dans des neuroblastomes que la stimulation du P2X7R entraîne la coupure protéolytique de NrCAM et que celle-ci est induite par ADAM17 (résultats préliminaires). Les ERM sont nécessaires car l’inhibition de leur expression par siRNA bloque ce clivage. Afin d’établir s’il existe une fixation des ERM à la région cytosolique de NrCAM, nous avons testé les différents mutants dans les cellules Neuro-2a et nous avons observé après stimulation du P2X7R le clivage de tous ces mutants (Figure 35). Ce résultat nous a amenés à faire l’hypothèse que les molécules de NrCAM mutantes s’associent aux molécules NrCAM endogènes entraînant leurs coupures (Tableau 8). Afin d’éviter ce problème, nous comparerons la coupure de NrCAM et de ses mutants dans les MEF, qui ne l’exprime pas spontanément. Ces expériences devraient nous permettre de déterminer si les mutants de NrCAM sans région cytosolique ou sans site de fixation potentiel aux ERM sont ou ne sont plus clivés.
Par ailleurs, Le Gall et coll. (228) ont montré que la stimulation du P2X7R entraîne un clivage de ligands des EGF-R tels que le TGF! et la betacelluline, respectivement par ADAM17 et ADAM10. Nous avons entrepris de déterminer quels sont les ligands des EGF-R, clivés par ADAM10 ou 17, dont le clivage protéolytique est dépendant des ERM.
Figure 35 : Représentation schématique des mutants de la molécule NrCAM obtenus par le Dr Faivre Saraillh.
Les différentes constructions de NrCAM sont étiquettées par l’épitope HA et/ou la GFP. Le mutant *Cyt (*Cytosolique) ne possède plus de région intracellulaire. Le mutant *Cter (*C-terminal) est constitué uniquement de la région susceptible de fixer les ERM dans sa région intracellulaire. Le mutant *PDZ ne possède plus son domaine PDZ. Enfin le mutant NrCAM *Fn n’a plus la région fibronectine-like qui contient la séquence consensus de coupure.
Tableau 8 : Résultats préliminaires obtenus sur NrCAM endogène, les mutants cités ci-dessus et sur la molécule L-selectine constituant le contrôle positif.
Les cellules des neuroblastomes murin Neuro-2a et humain SK-N-BE sont stimulées par 1mM de Bz-ATP. Cette activation provoque la coupure protéolytique de la molécule NrCAM endogène et des différents mutants. L’utilisation des inhibiteurs pharmacologique o-ATP et A-438079 démontre que cette coupure est dépendante du P2X7R. L’inhibition de l’expression d’ADAM17 par des si ARN réduit fortement la coupure de la molécule endogène. La transfection des mutants dans des cellules MEF double KO ADAM10 et 17 a les mêmes conséquences. L’inhibition des ERM provoque une nette diminution du clivage de NrCAM. Des expériences préliminaires de GST pull down, de GFP trap et de co-immunoprécipitation ont mis en évidence l’interaction des ERM avec les molécules NrCAM.
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NrCAM endogène NrCAM taggué HA NrCAM !Fn NrCAM !C-terminal NrCAM !Cytosolique L-Selectine
Coupure Coupure Coupure Coupure Coupure Coupure
Absence de coupure Absence de coupure Absence de coupure Absence de coupure Absence de coupure Absence de coupure
Coupure Coupure
Absence de coupure Absence de coupure
Coupure Coupure Coupure Coupure
Absence de coupure Absence de coupure Absence de coupure Absence de coupure
Absence de coupure Absence de coupure
En cours Positive Positive Positive En cours Positive Stimulation au Bz-ATP
Effet d'antagonistes du P2X7R Effet des siARN ADAM10 Effet des siARN ADAM17
Interaction avec les ERM MEF contrôle MEF dKO Ad10/17 Effet des si ARN ERM
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Objectif N°2 : Rechercher une interaction entre les substrats, les ADAM et les ERM.
Nous avons testé l’interaction potentielle de NrCAM et d’ADAM10 et 17 avec les ERM par des techniques d’immunoprécipitation classiques sans succès. Il est connu des scientifiques travaillant dans le domaine que la co-immunoprécipitation des ERM avec les molécules fixées est une tâche délicate. Nous avons donc utilisé des techniques recommandées par des experts de la biochimie des ERM (communication personnelle des Drs Arpin et Alcover).
1) La technique de « GFP » Trap utilise le domaine variable d’un anticorps anti-GFP de Lama Alpaca capable de fixer la GFP avec une très haute affinité qui est couplé à une matrice monovalente. Des cellules ont été transfectées par une construction comportant l’ezrine fusionnée à la GFP (expérimental) ou un plasmide codant la GFP (contrôle). Après transfection, les cellules ont été lysées et des immunoprécipités ont été réalisés avec du gel GFP-Trap. Les protéines fixées au gel sont analysées en western-blots avec des anticorps spécifiques des substrats et des ADAM. Nos résultats préliminaires montrent qu’ADAM10 et NrCAM interagissent avec l’ezrine et que cette interaction est dépendante de la stimulation par l’ATP.
2) Une méthode de « pull down » utilisant l’ezrine fusionnée à la Glutathion-S-tranférase est mise en œuvre avec les protéines fusions provenant des plasmides codant l’ezrine-fusionnée à la GST (expérimental), l’extrémité N-terminale de l’ezrine-GST (expérimental) et la partie C-terminale de l’ezrine-GST (contrôle négatif) (don des Dr Arpin et Alcover). Nous avons produit ces protéines fusions et nous avons montré qu’ADAM10 et NrCAM se fixent spécifiquement à ezrine-GST. Ce résultat préliminaire montre que dans certaines conditions l’interaction entre l’ezrine et la molécule pré-existe avant toute stimulation de P2X7R.
Ces deux types d’approches sont poursuivis et différentes méthodes de solubilisation des membranes sont en cours d’étude. En effet, des travaux récents ont montré que l’ADAM10 est associée à certaines tétraspanines ce qui nous incite à tester des détergents tels que le Brij97 qui permettent de maintenir le « réseau des tétraspanines » et les interactions avec ADAM10.
Objectif N°3 : Après stimulation du P2X7R, l’interaction des ADAM et des ligands des EGF-R à la membrane plasmique est-elle dépendante des ERM ?
Dans notre publication, nous avons utilisé la technique Duolink de PLA pour mettre en évidence l’interaction du P2X7R et de l’ezrine phosphorylée. Nous utiliserons cette méthode pour détecter une interaction entre un substrat et une ADAM et démontrer qu’elle est dépendante des ERM. Nous possédons des plasmides codant le TGF! normal ou une forme mutée du TGF! dans la région extracellulaire qui ne peut plus être coupée par ADAM17. Ces formes mutée et non-mutée de TGF! sont utilisées en collaboration avec les Drs Le Gall et Blobel. Les plasmides codant ces TGF! seront utilisés pour transfecter les cellules MEF wt, ADAM10 ko et ADAM17 ko. Après transfection, les cellules seront stimulées par du Bz-ATP ou par PMA/Ionomycine (pour agir en aval de P2X7R) et fixées par du paraformaldéhyde. Des anticorps anti-TGF! et anti-ADAM10 et 17 couplés à des oligonucléotides comme il est recommandé dans la méthode Duolink PLA, seront utilisés pour démontrer la proximité entre le TGF! et l’ADAM17. L’utilisation du TGF! non clivable est très importante car elle devrait permettre de stabiliser l’interaction avec l’ADAM17, alors que le TGF! normal sera coupé et libéré dans le surnageant de culture. Si le TGF! et l’ADAM17 sont colocalisés, la méthode du PLA permettra de détecter des points immunofluorescents qui seront absents des cellules MEFs ADAM17 ko. Le rôle des ERM dans cette interaction sera testé en transfectant les cellules MEFs par des siRNA spécifiques des ERM. Si l’interaction et le clivage sont dépendants des ERM, la proximité du TGF! et d’ADAM17 devrait disparaître dans les MEFs transfectées par les siRNA spécifiques et pas avec les siRNA contrôles.
Dans cette discussion, nous proposons comme généralisable le rôle des ERM dans la coupure de protéines de surface. Cependant, il est nécessaire de rappeler que les ERM peuvent être activées sans induire de coupure. La mutation R357A de CD62L abroge sa liaison aux ERM et inhibe sa coupure après une stimulation par le PMA. En revanche, la stimulation par la cantharidine, un activateur de la MAPKinase p38 induit la phosphorylation des ERM et entraîne la coupure de ce mutant de CD62L. Ainsi, comme le démontrent Killock et coll., la coupure de CD62L peut être le résultat de l’activation de deux voies biochimiques différentes dans l’une desquelles l’interaction substrat/ERM n’est pas requise (325). Cependant, dans cette étude les conséquences de l’inhibition de l’activation des ERM après une stimulation à la cantharidine n’ont pas été étudiées. En effet, des expériences de siARN spécifiques des
ERM n’ont pas été faites. Ainsi, on peut suggérer que l’activation des ERM et non leur interaction avec le substrat joue un rôle dans cette voie biochimique.
Par ailleurs, nous avons démontré que la phosphorylation des ERM n’est pas systématiquement associée à la coupure protéolytique des protéines membranaires. En effet, la stimulation des cellules Neuro-2a par le NGF (Nerve Growth Factor) active un récepteur à activité tyrosine kinase (TrkA) qui provoque la phosphorylation des ERM, sans entraîner le clivage de l’APP (cf. figure 6 des résultats de l’article JBC).