DISCUSSION ET PERSPECTIVES
1.3 Interaction P2X7R/Ezrine
Nous avons démontré que l’ezrine et la moesine étaient activées après stimulation du P2X7R par le Bz-ATP. La phosphorylation activatrice de la thréonine 567 de l’ezrine entraîne sa translocation du cytoplasme à la membrane plasmique où elle se lie au P2X7R.
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1.3.1 Site de fixation P2X7R/Ezrine a) Liaison directe
Les ERM interagissent directement avec de nombreuses protéines membranaires impliquées dans l’adhésion cellulaire telles que les ICAM et CD44. L’analyse des sites de fixation reconnus par les ERM ne permet pas d’identifier une séquence consensus. Cependant, les différentes séquences découvertes ainsi que les travaux de Yonemura sur la protéine CD44 démontrent qu’en général la liaison des ERM s’effectue sur des domaines cytosoliques de protéines de surface ayant un pHi basique (Tableau 7) .
Les ERM interagissent avec des régions riches en résidus basiques (156).
Protéines point isoélectrique Liaison aux ERM
CD44 8,17 Faible
CD43 9,24 Forte
ICAM2 12,98 Forte
E cadhérine 3,89 Inexistante
Occludine 5,85 Inexistante
Tableau 7 : Point isoélectrique de la région cytoplasmique des différentes protéines de surface. D’après (156).
Domaine C-terminal du P2X7R : pHi 8,68
NTYSSAFCRSGVYPYCKCCEPCTVNEYYYRKKCESIMEPKPTLKYVSFVDEPH
IRMVDQQLLGKSLQVVKGQEVPRPQMDFSDLSRLSLSLHDSPLTPGQSEEIQLL
HEEVAPKSGDSPSWCQCGNCLPSRLPEQRRALEELCCRRKPGRCITTSKLFHK
LVLSRDTLQLLLLYQDPLLVLGEEATNSRLRHRAYRCYATWRFGSQDMADFA
ILPSCCRWRIRKEFPKTEGQYSGFKYPY
Domaines N-terminaux du P2X7R :
Isoforme A : MPACCSWNDVLQYETNKVTRIQSTN pHi : 5,82
Isoforme K : MLPV - - - SHLCSHKSGKVLEIHSIW pHi : 8,02
Figure 30 : Régions cytoplasmiques du P2X7R murin
En rouge les résidus chargés positivement, en bleu les cystéines palmitoylées et surlignés en vert ou jaune les sites de fixation potentiels des ERM aux récepteurs.
Le pHi du domaine cytosolique C-terminal du P2X7R murin est de 8,68 et permet d’envisager différents sites potentiels d’interaction (Figure 30).
L’analyse de ce domaine montre que de nombreux sites basiques sont à proximité des cystéines palmitoylées (65). L’encombrement stérique dû à la palmitoylation permet d’envisager quatre sites d’interaction potentiels (peptides surlignés en vert). Cependant, nous n’avons pas preuve que les ERM interagissent uniquement avec les récepteurs P2X7 palmitoylés, localisés dans les radeaux lipidiques. En effet, à la membrane plasmique, environ 50% seulement des récepteurs P2X7 sont palmitoylés (65 , 316). On pourrait donc inclure aussi deux autres peptides surlignés en jaune qui sont proche des cystéines palmitoylées. Ces peptides deviendraient accessibles aux ERM dans le P2X7R non palmitoylé.
La région intracytoplasmique N-terminale du P2X7R est différente suivant qu’il s’agit de l’isoforme A ou K. Pour l’isoforme A, le pHi est de 5,82, alors que sa valeur est de 8,02 pour
l’isoforme K. L’analyse de la séquence peptidique montre qu’il existe un site potentiel de liaison aux ERM pour chacune des isoformes (surligné en vert) (Figure 30).
Expériences programmées :
Les séquences peptidiques qui pourraient interagir avec le domaine FERM des ERM seront synthétisées et biotinylées en position carboxy-terminale avec un espaceur hydrophile pour permettre une bonne interaction avec la streptavidine. Dans une seconde étape, les peptides biotinylés seront incubés avec les protéines Ezrine-GST et Ezrine tronquée-GST. Ces mélanges seront ensuite filtrés sur billes d’agarose couplées à la streptavidine. Après lavages en tampon physiologique, les éluats des billes seront analysés en western-blot pour détecter la présence ou non d’ezrine. Un contrôle positif important sera utilisé pendant ces expériences, il
s’agit du peptide de CD44, SRRRCGQKKKLVINGGNGTV biotinylé, qui est connu pour
interagir avec un KD d’environ 10nM pour l’ezrine et de 120nM pour la radixine.
Si l’on identifie un ou deux peptides capables d’interagir avec l’ezrine, nous pourrons faire synthétiser des peptides mutants dans lesquels les résidus basiques seront remplacés par des alanines. Ces expériences nous permettront de programmer des mutations dans la séquence peptidique du P2X7R interagissant avec l’ezrine. Nous produirons des plasmides contenant la ou les séquences mutées du P2X7R. Ces plasmides seront utilisés pour transfecter la lignée humaine HEK293 qui n’exprime aucun récepteur P2X. Ces transfectants seront ensuite stimulés par l’ATP ou le Bz-ATP et la capacité de ces transfectants à cliver l’APP ou d’autres protéines transmembranaires sera étudiée. Si les transfectants expriment des récepteurs P2X7 fonctionnels capables de stimuler le clivage protéolytique des molécules telles que l’APP, CD62L etc, nous aurons la preuve que la liaison aux ERM du P2X7R n’est pas indispensable à la coupure des substrats membranaires. Cependant, nous devrons nous assurer par des techniques de PLA que les récepteurs mutés n’interagissent pas avec les ERM malgré les mutations effectuées.
Cependant, si aucun des peptides analysés dans la région C-terminale ne lient les ERM, nous étudierons la capacité des peptides N-terminaux du récepteur à fixer les ERM. Les peptides surlignés en vert seront testés comme décrit dans le paragraphe précédent (Figure 30). La fixation des ERM à la région N-terminal du P2X7R provoquerait son ancrage à la F-actine et par voie de conséquence son immobilisation. Cependant, l’étude de l’équipe de Renner (47) est en défaveur de cette hypothèse. En effet, dans des cellules primaires neurales transfectées,
la mutation de la lysine 17 en alanine provoque une diminution de la diffusion des récepteurs P2X7 dans la membrane plasmique même après une stimulation à l’ATP. Ainsi, si ce résidu participait à la liaison aux ERM, nous nous attendrions à observer une augmentation de la mobilité pour ce mutant (47).
b) Liaison indirecte
Il n’est pas exclu que les ERM lient indirectement les parties cytosoliques du P2X7R par l’intermédiaire de protéines adaptatrices car la technique de PLA détecte la proximité de deux protéines à condition qu’elles ne soient pas distantes de plus de 28Å. En effet, l’interaction des ERM avec les protéines membranaires CFTR et NH3 est indirecte et met en jeu des phosphoprotéines à domaines PDZ : EBP50 et NHERF (318). La région C-terminale de ces protéines interagit avec les ERM et leurs domaines PDZ lient la région transmembranaire des glycoprotéines de la membrane plasmique.
Par ailleurs, deux études de protéomique ont identifié de nombreuses protéines interagissant avec le P2X7R dans des cellules HEK et THP-1 (18 , 61). Dans ces études, les ERM ou les protéines adaptatrices n’ont pas été co-immunoprécipitées avec le récepteur (18 , 61). Les résultats obtenus peuvent s’expliquer par l’absence de toute stimulation du récepteur P2X7 avant co-immunoprécipitation de ce dernier dans l’étude de Kim et coll. (18). Or, la liaison des ERM au récepteur n’a lieu qu’après activation de celui-ci. Par contre, dans leurs travaux Gu et coll. ont stimulé les récepteurs P2X7 par l’ATP avant co-immunoprécipitation et observent la disparition de la myosine II non-musculaire mais pas d’association des ERM confirmant la difficulté rencontrée par tous les groupes à co-immunoprécipiter les ERM avec les protéines qu’elles fixent.
Nos résultats de co-immunoprécitation n’ont pas permis de montrer une interaction entre les ERM et le P2X7R (résultats préliminaires). Cependant, l’absence de co-immunoprécipitation des ERM avec P2X7R pourrait s’expliquer par la difficulté technique rencontrée par la majorité des chercheurs désireux de mettre en évidence une telle interaction. En effet, cela pourrait être dû à la liaison directe du domaine C-ERMAD des ERM à l’actine entraînant une agrégation des complexes et leur précipitation avec cette dernière.