DISCUSSION ET PERSPECTIVES
1.1 Etude de la voie biochimique
Les travaux du Dr Delarasse et coll. ont montré que la stimulation du P2X7R entraîne l’activation des modules de MAPKinases : ERK1/2, JNK et p38 :Q>S=. Seuls les inhibiteurs ciblant MEK et JNK diminuent la libération de sAPP! dans les surnageants. Dans ce contexte, nous avons souhaité positionner, dans la voie biochimique, l’activation de ERK et JNK par rapport à la phosphorylation des ERM. L’inhibition pharmacologique de ERK et JNK provoque une inhibition de l’activation des ERM. En revanche, l’inhibition de l’expression des ERM par siARN n’a aucun effet sur la phosphorylation des
MAP-KinasesERK1/2 et JNK. Ces résultats indiquent que ERK et JNK agissent en amont de l’activation
des ERM (Figure 28). Il serait donc intéressant de déterminer si ces deux sérine-thréonine kinases agissent directement sur les ERM ou si elles activent d’autres cibles de la voie biochimique conduisant à la stimulation des ERM. En effet, l’activation par phosphorylation
! de la thréonine en position C-terminale des ERM a été attribuée à de nombreuses kinases (Tableau 3) mais à notre connaissance, pas aux MAPKinases.
Figure 28 : Représentation schématique de la voie biochimique impliquée dans la coupure de l’APP suite à l’activation du P2X7R.
La stimulation du P2X7R provoque l’activation de la RhoKinase et des MAPKinases ERK1/2 et JNK. Ces sérine/thréonine kinases phosphorylent directement ou indirectement les ERM qui vont migrer à la membrane plasmique et interagir avec le P2X7R aboutissant in fine à la coupure en ! de l’APP.
La phosphorylation activatrice des ERM est souvent attribuée à une kinase qui est également activée par la stimulation du P2X7 : la Rho-kinase (123). Dans nos travaux, l’utilisation de l’inhibiteur pharmacologique ciblant la Rho-kinase (le fasudil) entraîne une nette diminution de la phosphorylation des ERM et de la coupure neuroprotectrice de l’APP. Ainsi, nos résultats montrent que la stimulation du P2X7R active la Rho-kinase aboutissant à l’activation des ERM. Cependant, on ne peut exclure que la Rho-Kinase agisse en amont de la kinase phosphorylant les ERM, d’autant plus que de nombreux travaux suggèrent fortement que ce n’est pas la Rho-kinase qui les active. En effet, Belkina et coll. ont démontré qu’une kinase, appartenant à la famille des kinases STE est responsable de la phosphorylation des ERM dans
les cellules hématopoïétiques :>QV=. Leurs résultats in vitro et in vivo démontrent que
renforce des données obtenues précédemment dans lesquelles la kinase SLIK, également de la famille STE, est responsable de la phosphorylation des ERM chez la drosophile. Il serait donc intéressant de déterminer si, dans notre modèle expérimental, une kinase de la famille STE est responsable de l’activation des ERM.
Gautreau et coll. ont montré que la sous-unité catalytique p85 de la PI3K se liait à l’ezrine. Cette interaction fait appel à deux sites distincts de l’ezrine : les 309 acides aminés de la partie N-terminale et de la tyrosine phosphorylée 353 qui s’associe au domaine SH2 de la partie C-terminale de la sous-unité régulatrice p85. L’association des ERM à cette sous-unité relaye l’activation de la voie Akt/PKB et favorise la survie cellulaire dans les cellules épithéliales LLC-PK1 :>SQ=?
Dans notre modèle, l’activation du P2X7R stimule l’activité de la PI3K (Figure 28). L’utilisation de la wortmannin, un inhibiteur non spécifique des phosphatidylinositol kinases, et de LY294002, un inhibiteur spécifique des PI3K, montre que celle-ci est nécessaire à la coupure de l’APP. En revanche, l’utilisation de ces inhibiteurs n’a pas d’effet sur la phosphorylation des ERM.
La PI3K agit donc en aval des ERM. L’activité de la PI3K n’induit pas la phosphorylation d’Akt et ne semble donc pas activer une voie de survie. Ces résultats sont en accord avec les résultats obtenus précédemment, dans notre équipe, sur le rôle de la PI3K dans la mort
nécrotique des thymocytes après stimulation du P2X7R :YU=. En effet, dans la cascade
enzymatique déclenchée par P2X7R dans les thymocytes de souris, l’activation de la PI3K
n’aboutit pas à une phosphorylation d’Akt :YU=. De plus, l’inhibition de l’activité mToR
(mammalian target of Rapamycin) par la Rapamycine ne bloque pas la voie de mort stimulée par la PI3K :YU=d!montrant ainsi que la voie biochimique mise en jeu est différente de la voie de survie cellulaire stimulée par Akt et son substrat mToR.
Il existe un autre modèle expérimental dans lequel la PI3K, activée, intervient dans la voie biochimique aboutissant au clivage de l’APP et à la libération de sAPP# (Figure 29). Kojro et coll. :@SY=!ont montré que le récepteur couplé aux protéines G, PAC1, stimulé par le peptide neuropituitaire activateur de l’adénylate cyclase (PACAP) provoque une activation des sécrétases-# entraînant la coupure non amyloïdogénique de l’APP :@SY=?!L’étude des voies biochimiques mises en jeu montre que la voie dépendante de l’AMP-cyclique et de la PKA n’intervient pas dans le clivage de l’APP et que la PKC y joue un rôle modéré. Par contre, l’activation des MAP-kinases Erk1/2 est indispensable à l’activation des ADAM et au clivage de l’APP :@SY=. De plus, il a été clairement démontré que la PI3Kinase est fortement activée
et que son inhibition abolit l’activation du module de MAP-kinaseErk1/2 et la libération de sAPP# (Figure 29) :@SY=. On voit donc que, dans ce modèle expérimental, l’activité PI3kinase est en amont des MAP-kinases Erk1/2, alors que dans notre modèle elle est située en aval des MAP-Kinases Erk1/2. Il est donc clair que l’activité PI3K indispensable à la stimulation de la protéolyse par les ADAM dans les deux modèles n’agit probablement pas sur les mêmes cibles moléculaires.
Figure 29 : Représentation schématique de la voie biochimique aboutissant à la libération du fragment sAPP", suite à la stimulation du récepteur PAC1 par son ligand PACAP.