L’utilisation de AZ64 un inhibiteur de NTRK augmente l’efficacité de la radiothérapie et inhibe la survie tumorale dans des modèles de xénogreffes de neuroblastome. Etant donné que la composition des exosomes sécrétés par des cellules exposées à différents stress dont la radiothérapie est modifiée, notre choix s’est naturellement porté sur l’étude de l’expression des récepteurs aux neurotrophines au sein des exosomes ainsi que leur implication dans les mécanismes de radiorésistance (Iyer et al., 2012; Villarroya-Beltri et al., 2014).
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 193 L’augmentation de l’expression de l’EGFRvIII semble être plus importante après ajout d’exosomes dans les 2 lignées cellulaires. Ce résultat semble corroborer l’hypothèse d’Al-Nedawi (Al-Nedawi et al., 2008) selon laquelle l’EGFRvIII serait véhiculé par les exosomes issus de cellules de glioblastomes permettant la propagation de l’agressivité cellulaire. Dans notre cas, l’apport d’EGFRvIII pourrait participer à la mise en place des mécanismes de radiorésistance. Il a en effet pu être constaté que l’expression d’EGFRvIII favorisait l’activation de protéines de réparation et ainsi permettait de réparer les cassures à l’ADN (Mukherjee et al., 2009).
Une perte d’expression de TrkB, de p75NTR et de la sortiline après radiothérapie dans
les U87-MG a pu être observée. Leur expression est cependant restaurée après traitement aux exosomes. Dans la lignée inactivée pour Rab27a, les mêmes
variations sont observées sauf pour p75NTR dont l’expression augmente après
radiothérapie, et non après traitement aux exosomes.
Il semblerait donc que TrkB et la sortiline soient transférés aux cellules cibles par les exosomes ajoutés en fin d’irradiation suggérant un transfert de ces protéines aux cellules irradiées qui pourrait être responsable de l’augmentation de la prolifération. Ce résultat semble en accord avec les données de la littérature montrant que l’inhibition de TrkB par AZ64, un inhibiteur de Trk, augmente l’efficacité de la radiothérapie et inhibe la survie tumorale. Il sera par la suite intéressant de regarder si le récepteur TrkB est transporté par les exosomes sous sa forme active phosphorylée ou inactive. De la même façon que pour nos premiers résultats, l’analyse des voies de signalisation permettant la prolifération cellulaire dans les cellules cible devra être recherchée. Selon le type de cancer, les récepteurs aux neurotrophines sont associés à un bon (mort et régression tumorale) (Grotzer et al., 2000; Nakagawara et al., 1993) ou à un mauvais pronostic (survie et progression tumorale) (Wadhwa et al., 2003; Xiong et al., 2015). Dans le cas du glioblastome, la signalisation des neurotrophines semble présenter une dualité fonctionnelle, mais leur fonction exacte reste encore controversée et peu étudiée. Il a été montré que l’expression de TrkB était de mauvais pronostic via l’augmentation de l’angiogénèse et de l’agressivité (Brodeur et al., 1997). La sortiline, quant à elle, agit comme un co-récepteur des neurotrophines et présente elle aussi une dualité fonctionnelle. Complexée au récepteur de haute affinité TrkB, elle permettrait la survie cellulaire en liant les neurotrophines (Akil et al., 2011). Notre étude montre un profil similaire entre
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 194 TrkB et la sortiline dans les cellules, de telle sorte que ces 2 protéines pourraient former un complexe permettant l’activation de voies de survie. Dans le cancer du poumon, un complexe hétérotrimérique, le complexe TES (TrkB-EGFR-sortiline) a récemment été identifié et participe à l’angiogenèse tumorale via son tranfert par les exosomes (Wilson et al., 2014b). Dans le GBM, notre hypothèse serait que ce complexe pourrait participer au phénomène de radiorésistance via son transfert par les exosomes. Des expériences d’immunoprécipitations devront être réalisées pour déterminer s’il existe un complexe transporté au sein des exosomes de GBM ainsi que la nature de ce dernier.
Quant au récepteur p75NTR, il semblerait être un régulateur central de l’invasion gliale (Johnston et al., 2007). La radiothérapie entraine une sécrétion de p75NTR dans les exosomes issus de cellules U87-MG mais aussi dans les exosomes issus de cellules U87 shRab27a. Ces exosomes pourraient faciliter l’invasion tumorale (Yang and Robbins, 2011). Ce mécanisme pourrait s’appuyer sur le transfert de la protéine p75NTR via les exosomes.
Enfin, la forte expression de p75NTR dans les exosomes issus des cellules U87 shRab27a indique que leur sécrétion n’est pas totalement dépendante de Rab27a. Des travaux indiquent qu’il existe différentes populations de vésicules qui contiennent plus spécifiquement certains récepteurs que d’autres (Bobrie et al., 2012b). Il pourrait y avoir une sécrétion de microvésicules particulières n’exprimant pas CD9 qui seraient produites par les cellules U87 shRab27a. Cette protéine connue également pour être impliquée dans la sécrétion des exosomes (Ostrowski et al., 2010), pourrait contrôler l’adressage du p75NTR dans les exosomes et son relargage dans le milieu environnant.
Dans la poursuite de ce travail, une inhibition de la sécrétion exosomale à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques tel que la Diméthyl Amiloride (DMA) (Savina et al., 2002) pourrait être envisagé. La DMA est un inhibiteur des échangeurs Na+/H+ et Na+/Ca2+ qui participent respectivement au contrôle du pH intracellulaire et au contrôle de la concentration de calcium intracellulaire. Le calcium cytosolique est nécessaire à la fusion des MVB à la membrane plasmique. L’absence de calcium inhibe la sécrétion des exosomes
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 195 Par la suite, la purification les différentes sous-populations de vésicules, notamment par gradient de sucrose permettrait de les caractériser en spectrométrie de masse pour obtenir une analyse exhaustive du contenu protéique.
Si plusieurs travaux en oncologie ont suggéré l'implication des exosomes dans des phénomènes de résistance aux traitements, aucune donnée n’est disponible concernant les variations d’expression des neurotrophines contenus au sein des exosomes à la suite d'une irradiation. Ces données obtenues semblent aller en faveur de l'existence de phénomènes adaptatifs de résistance à l'irradiation médiés par le transfert d’un cargo spécifique via les exosomes. Ces résultats soulignent l'intérêt de la réalisation d'une étude à l’échelle du patient. Au cours de notre projet nous avons pu mettre en place une étude clinique avec recueil de sérum de patients porteurs d'un gliome de haut grade avant et après traitement par radio-chimiothérapie concomittante selon le protocole STUPP. La mise au point des conditions expérimentales est à ce jour en cours et nous espérons pouvoir confirmer prochainement nos résultats ex vivo.
Le transfert de matériel protéique via les exosomes produits au cours de la radiothérapie permet d’exercer un contrôle sur le microenvironnement. Cependant, notre approche actuelle ne nous a pas permis d’étudier l’effet des exosomes et de leur contenu sur le microenvironnement.
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