Nous avons utilisé la technique d’extinction de gènes (shRNA) par utilisation de vecteurs lentiviraux. Cette technique utilise des plasmides contenant une séquence permettant l’extinction du gène d’intérêt.
I.5.1. Amplification du plasmide porteur de la séquence d’intérêt
Les plasmides utilisés sont des vecteurs circulaires pLKO.1 commerciaux (Réf. SHC001) (Sigma-Aldrich). La carte de ce plasmide est présentée ci-dessous (Figure 23).
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Figure 23 : Carte du vecteur pLKO.1 utilisé pour l’extinction de gènes par shRNA.
Cppt: Central polypurine tract, hPGK: Human phosphoglycerate kinase eukaryotic promoter, puroR: Puromycin resistance gene for mammalian selection, SIN/LTR: 3' self inactivating long terminal repeat, f1 ori: f1 origin of replication, ampR: Ampicillin resistance gene for bacterial selection, pUC ori: pUC origin of replication, 5' LTR: 5'
long terminal repeat, Psi: RNA packaging signal, RRE: Rev response element.
Pour chaque gène d’intérêt, plusieurs clones sont testés afin de choisir celui dont l’efficacité d’extinction est optimale. Chaque clone correspond au vecteur pLKO.1 comprenant la séquence spécifique du gène qu’il éteindra.
Les plasmides sont donc dans un premier temps amplifiés par transformation bactérienne. 20ng de plasmide (soit 1µL) sont ajoutés à 50µL de bactéries DH5α compétentes (Invitrogen) préalablement mises sur glace. Le mélange est incubé sur
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 119 glace pendant 30 min. L’insertion du plasmide dans les bactéries se fait par choc thermique à 42°C pendant 45s, les tubes contenant les bactéries sont ensuite replacés sur glace pendant 2min. Pour chaque transformation bactérienne, 950µL de milieu Luria Broth sans antibiotique (LB, sigma aldrich) est ajouté et les tubes sont incubés 1h à 37°C sous agitation (225rpm). Les bactéries transformées sont ensuite étalées sur boites de LB gélosé (200µL de bactéries par boite) contenant un antiobiotique de sélection : l’ampicilline (100µg/mL, Invitrogen) (le plasmide pLKO contient un gène de résistance à l’ampicilline, Figure 22). Les boites ensemencées sont incubées à l’envers à 37°C sur la nuit. Le lendemain, une colonie est repiquée et ensemencée dans 5mL de LB liquide contenant de l’ampicilline et incubée à 37°C sous agitation pendant environ 6h. 200µL de suspension bactérienne (bactéries amplifiées) sont ensuite déposés dans 100mL de LB contenant de l’ampicilline et incubée à 37°C sous agitation toute la nuit.
Après amplification des bactéries transformées, celles-ci sont récupérées et une Midi prep est effectuée avec le kit NucleoBond Xtra Midi kit (Macherey-Nagel, France) afin d’extraire le plasmide amplifié. Brièvement, les bactéries sont centrifugées 5000 x g pendant 10min à 4°C, les culots sont ensuite lysés. Les lysats sont lavés, l’ADN est élué puis précipité dans de l’isopropanol. Après centrifugation (6000 x g, 45min, 4°C) le culot d’ADN est lavé à l’éthanol et centrifugé à nouveau (6000 x g, 10min, température ambiante). Après élimination et évaporation de l’éthanol, l’ADN est reconstitué dans 200µL d’eau ultrapure. La concentration des en ADN plasmidique déterminée par lecture de la densité optique à 260nm avec un Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer, Labtech, France).
I.5.2. Transformation des cellules HEK293T
Afin de produire les lentivirus contenant le plasmide d’intérêt pour chaque gène, il est indispensable de passer par une étape de transfection de cellules HEK293T (Human Embryonic Kidney). Ces cellules 293T sont modifiées et possèdent un insert contenant l’antigène SV40 T. Ces cellules permettent donc la production de virions à partir de la transfection au JetPEI des plasmides d’interêts. Le jetPEI est un polycation linéaire qui forme avec l'ADN des agrégats faiblement toxiques et plus stables que ne le sont les complexes lipides-ADN. Dans la cellule, il se comporte
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 120 comme une « éponge à protons » : il induit la rupture des endosomes par gonflement osmotique, provoquant le largage rapide de l’ADN dans le cytoplasme tout en le protégeant des nucléases cytosoliques (figure 24).
Figure 24 : Principe de la transfection cellulaire par le réactif JetPEI
(Schéma Polyplus Transfection). Le complexe JetPEI-ADN formé pénètre dans la cellule par endocytose. Il est libéré au de l'endosome niveau du cytosol par un effet dit "effet éponge".
Les cellules sont ensemencées au jour 1 (J1) à une densité d’environ 2 à 2,5.106
cellules par flasque de 75cm2 (falcon) pour chaque transfection contenant 10mL de
milieu de culture. A J2, la transfection est effectuée : cette étape est réalisée avec du milieu de culture ne contenant ni SVF, ni antibiotiques pour des cellules ayant une confluence entre 50% et 70% dans les plaques 6 puits. Le plasmide d’intérêt (3,5µg) ainsi que le « packaging » sont dilués dans un volume final de 250µL de NaCl 150mM et parallèlement le JetPEI (20µL) est dilué dans un volume final de 250µL de NaCl 150mM. Le mélange s’effectue en ajoutant délicatement 100µL de la solution de JetPEI diluée aux 100µL de la solution contenant l’ADN (attention, pas l’inverse). L’homogénéisation est réalisée au vortex pendant 3s puis le tout est incubé 20min à température ambiante. Pendant cette incubation, le milieu de culture des cellules est remplacé par 2mL de milieu de culture complet frais dans les puits contenant les cellules. La totalité du mélange de transfection est mise en contact avec les cellules. Après 24h à 48h, les cellules sont analysées.
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I.5.3. Infection lentivirale des cellules U87-MG
Le protocole d’infection débute à J4 : le milieu de culture des cellules HEK293T transfectées est récupéré et remplacé par du milieu frais, les cellules sont ensuite replacées à l’incubateur. Le surnagent des cellules HEK293T est ensuite centrifugé pendant 5min à 3000rpm à température ambiante afin de culotter les cellules ou les débris et de garder les virions dans le surnagent. Parallèlement, 2mL de milieu frais sont déposés dans des tubes auxquels sont ajoutés 8µg par mL (pour les 10mL finaux de chaque flasque) de polybrène (Sigma-Aldrich) qui permettra une augmentation de l’efficacité d’infection. Après centrifugation, 8mL de surnagent sont récupérés et ajoutés au 2mL de milieu contenant le polybrène. Enfin, le milieu de culture des cellules U87-MG est éliminé et remplacé par le surnagent des cellules HEK293T additionné de milieu de culture frais et de polybrène. Les cellules sont ensuite replacées à l’incubateur.
Le sixième jour de ce protocole (J6) correspond à la sélection des cellules ayant intégré le plasmide et donc ayant une extinction du gène d’intérêt. Pour cela, le milieu de culture des cellules U87-MG infectées est éliminé et remplacé par du milieu de culture frais contenant 1µg/mL de puromycine. Cet antibiotique permet de tuer les cellules ne possédant pas de gène de résistance à la puromycine. Au contraire, les cellules ayant intégré les virus et donc le plasmide d’intérêt possèdent un gène de résistance à la puromycine présent dans la séquence du plasmide (cf carte du plasmide Figure M1). Les cellules sont alors incubées 72h avec ce milieu de culture de sélection. A J9, les cellules U87-MG sont passées, et le milieu de culture changé et remplacé par du milieu de culture contenant 0,5µg/mL de puromycine afin de toujours maintenir une pression de sélection. Les cellules peuvent alors être utilisées pour différentes expérimentations.
I.6. Analyse transcriptomique par qPCR