• Préparation des échantillons protéiques :
Pour l’analyse cellulaire ; les cellules issues des différentes conditions sont préalablement lavées dans du PBS 1X, culotées à 1500 rpm pendant 10 minutes et lysées dans du tampon de lyse RIPA (composition) pendant 30 min sur glace.
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 129
Pour l’analyse exosomale ; après ultracentrifugation, le culot contenant les
exosomes est lysé dans du tampon de lyse (RIPA) pendant 30 min sur glace.
Le lysat protéique cellulaire ou exosomal est ensuite homogénéisé puis centrifugé à 10 000 g pendant 25 min à 4°C. Le surnageant contenant les protéines exosomales ou cellulaires totales est alors récupéré.
• Dosage de Bradford :
La concentration en protéines totales est déterminée selon un dosage colorimétrique basé sur l’utilisation du réactif de Bradford (Sigma Aldrich, France). La gamme étalon de la réaction est réalisée à l’aide d’une solution de BSA (Sigma Aldrich) de
concentration connue (de 0 µg/mL à 2000 µg/mL). Les densités optiques (DO)
obtenues pour chaque solution sont mesurées grâce à un spectrophotomètre à la longueur de 595 nm. La droite étalon permet de mesurer la concentration de chaque solution à partir de la DO obtenue.
• Electrophorèse en gel de polyacrylamide :
30 µg de protéines ont été dilués dans du tampon laemmli (Biorad, France) puis dénaturés 5 min à 95°C. Les lysats protéiques dénaturés sont ensuite déposés dans différents puits du système de migration et un marqueur de poids moléculaire (Fisher, France) est utilisé comme référence pour déterminer les poids moléculaires des protéines d’intérêts.
La séparation protéique est réalisée par migration électrophorétique en gel pré coulé avec gradient de polyacrylamide (4 à 15%) contenant du SDS (10%) (BioRad, France). La migration s’effectue pendant 1h (130 V) dans un tampon de migration (Tris-HCL 25 mM, pH 8,5 /Glycine 250 mM/SDS 0,1%) (BioRad).
• Transfert des protéines sur membrane de PVDF (polyfluorure de vinylidène)
Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF (Pall) préalablement activée quelques minutes dans un bain de méthanol (Sigma Aldrich, France) puis équilibrée dans le tampon de transfert (Tris/Glycine/méthanol, BioRad). Le gel de polyacrylamide est également équilibré quelques minutes dans le tampon
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 130 de transfert avant d’être mis en contact avec la membrane selon les instructions du fabricant (BioRad). Le transfert s’effectue pendant 30 minutes à 20V.
• Immunodétection des protéines :
Afin de bloquer les sites de fixation non spécifiques des anticorps sur la membrane, une saturation des membranes est effectuée avec une solution de TBS1X, 0,1 % tween contenant 5 % de lait écrémé pendant 1h sous agitation à température ambiante. Les membranes de PVDF sont ensuite incubées sur la nuit à 4°C sous agitation avec l’anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt, dilué soit dans du TBS 1X/Tween 0,1%/lait 5%, soit dans du TBS 1X/Tween 0,1%/BSA 5% (tableau 3). Les membranes sont ensuite rincées en TBS1X/tween 0, 1% 3 fois pendant 5 min puis incubées avec l’anticorps secondaire couplé HRP (Horseradish Peroxydase) correspondant, à l’hôte de l’anticorps primaire utilisé. Les anticorps secondaires sont dilués dans du TBS1X/tween0.1%/lait 5% (tableau 4) pendant 1 heure à température ambiante.
Les protéines de la membrane sont détectées par chémiluminescence (Millipore, France). La peroxydase en présence d’H2O2 permet l’oxydation du diacylhydrazide en un composé lumineux. Les photons émis au cours de cette réaction sont détectés grâce à une Gbox (Genesnap Syngene, Cambridge, UK) qui possède une caméra sensible aux photons. Pour quantifier les protéines contenues dans chaque lysat protéique, les membranes sont réhybridées soit avec un anticorps dirigé contre l’actine (Sigma-Aldrich) pour les lysats cellulaires, soit avec un anticorps dirigé contre CD63 (Biorad) pour les lysats exosomaux.
Une quantification des expressions protéiques de chaque échantillon cellulaire est réalisée en comparant l’intensité d’expression de la protéine d’intérêt à l’intensité de l’actine ou de CD63 grâce au logiciel image J.
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 131 Anticorps Taille kDa Hôte Dilution Fournisseur
EGFRvIII(novocastra) 175 souris 1/125 Leica Biosystem
EGFR 145 souris 1/1000 Cell signaling
CD63 60-70 souris 1/1000 AbD SEROTEC MCA2142
Rab27 25 lapin 1/500 Sigma Aldrich HPA001333
CHI3L1/YKL-40 43 lapin 1/1000 ABCAM
TrKB 145-95 souris 1/200 R&D
P75 75 lapin 1/300 Santa Crouz
Sortiline 95 souris 1/1000 BD Bioscience
CD9 27 lapin 1/500 Sigma
Flotillin 47 lapin 1/1000 Cell signaling
TSG101 45 lapin 1/500 Cell signaling
CD44 80 lapin 1/1000 Sigma
GFAP 50 lapin 1/200 DAKO
N-cadhérine 100 souris 1/500 Sigma
Alpha-SMA 43 souris 1/500 Sigma
Runx2 27 lapin 1/500 Sigma
TrkC 145 souris 1/200 R&D
BDNF 27 lapin 1/500 Sigma
NGF 27 lapin 1/500 Sigma
NT3 27 lapin 1/500 Sigma
HSP90 90 lapin 1/500 Sigma
Actine 42 souris 1/10000 Sigma
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 132 Anticorps Hôte Dilution Fournisseur
Anti mousse HRP Mouton 1/1000 DAKO
Anti rabbit HRP mouton 1/1000 DAKO
Tableau 4 : Liste des anticorps secondaires utilisés en western blot.
I.10.2. Immunofluorescence indirecte
L’internalisation des exosomes a été étudiée par immunofluorescence sur différentes
lignées. Les cellules (2 x 105) sont ensemencées par puits en plaque 6 puits où ont
été préalablement déposées des lamelles de verre. Après irradiation, 30 µg/mL
d’exosomes issus de la lignée U87CD63 GFP sont ajoutés dans chaque puits. Après 48h de culture, le surnageant est retiré et conservé et les cellules sont perméabilisées grâce à l’ajout de méthanol glacé pendant 5 minutes. Après 3 lavages en PBS stérile, une saturation des sites de fixation non spécifique est réalisée par incubation des cellules avec une solution de PBS-BSA 4% pendant 2 heures à température ambiante. Les cellules sont lavées en PBS puis incubées sur la nuit à 4°C avec des anticorps primaires dilués dans la solution de saturation (tableau 5). Après 3 lavages en PBS, l’anticorps secondaire anti-Ig de souris couplé à un fluorochrome est incubé avec les cellules pendant une heure à température ambiante (tableau 6). Un marquage au Dapi dilué au 1/10000 en PBS, pendant 10 min à température ambiante à l’abri de la lumière est effectué. Après lavage, les lames sont montées en mowiol 4-88 puis laissées sécher à 4°C pendant 24h. Les cellules ayant incorporées les exosomes sont analysées en microscopie confocale (LSM 510 META, ZEISS).
Anticorps Hôte Dilution Fournisseur
CD63 souris 1/1000 AbD SEROTEC
MCA2142
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 133
Spécificité Hôte Dilution Fluorochrome Fournisseur
Ig totale de souris
Chèvre 1/5000 Alexa fluor
594
Invitrogen
Tableau 6 : Liste des anticorps secondaires utilisés en western blot.