Les exosomes exercent un contrôle permanent sur le microenvironnement tumoral. Parmi, les cellules cibles présentes dans celui-ci, on trouve notamment les CSM. Dans cette dernière partie de mon travail, l’objectif était d’étudier l’impact d’exosomes de GBM sur les cellules du microenvironnement à savoir les astrocytes sains et les CSM. Ces effets ont ou être analysés en modulant l’état d’agressivité des cellules
productrices d’exosomes, à savoir une population enrichie en cellules souches
cancéreuses (milieu défini), une population cellulaire ayant perdu ses propriétés tumorigènes (U87 shCHI3L1) en comparaison à la lignée parentale (U87-MG). En parallèle, l’effet de la radiothérapie dans la modulation du phénotype des CSM a été évalué selon le même principe.
Les CSM ont la capacité de migrer spécifiquement vers les tumeurs et les métastases à travers l’organisme ou de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) pour atteindre les gliomes (Gao et al., 2010a). Actuellement, une importante controverse existe concernant la fonction des CSM sur la croissance tumorale puisqu’une partie des études met en évidence l’action pro-tumorale des CSM alors que l’autre partie met en avant leur capacité anti-tumorale. En effet, le rôle des CSM dans les tumeurs et en périphérie tumorale n’est pas encore bien élucidé et certaines études semblent indiquer que les CSM augmenteraient le développement tumoral de différentes manières (Karnoub et al., 2007). (i) par la création d’une niche pour les cellules souches cancéreuses, (ii) en détériorant la surveillance du système immunitaire, (iii) par leurs propriétés pro-antigéniques via la sécrétion de VEGF (Yu et al., 2008a).
D’autres études démontrent leur rôle anti-tumoral (Lazennec and Jorgensen, 2008).
Ainsi, Nakamura et al. ont mis en évidence des effets anti-tumoraux et une prolongation de la survie dans un modèle de gliome notamment grâce à l’injection de CSM modifiées surexprimant l’IL-2. Le mécanisme d’action mis en jeu n’a pas pu être
mis en évidence mais il s’agirait d’un mécanisme indirect (Nakamura et al., 2004). De
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 197 de la moelle osseuse (BM-MSC), modifiées pour exprimer du PEDF (Pigment epithelium-derived factor) et administrées par voie intraveineuse exercent un effet anti-tumoral significatif sur un modèle d’hépatocarcinome orthotopique (Gao et al., 2010b). De plus, cet effet est corrélé́ avec une diminution de la néoangiogénèse tumorale (Gao et al., 2010b).
L’impact des exosomes tumoraux sur les astrocytes sains n’a pas pu être déterminé, notre recherche s’est orientée sur les CSM qui ont un tropisme pour les cellules
tumorales et notamment pour les gliomes, in vivo, lorsqu’elles sont administrées par
IV (Kosztowski et al., 2009). Dans un premier temps, l’impact de ces exosomes a pu être mis en évidence au travers de changements morphologiques des cellules réceptrices (BM-MSC). La densité cellulaire des CSM semble modérément modifiée
après traitement aux exosomes issus de la lignée parentale U87-MG, tandis qu’un
traitement aux exosomes issus d’une population enrichie en CSC l’augmente drastiquement. De plus les cellules semblent former un front de migration constitué de plusieurs couches cellulaires. Concernant le traitement aux exosomes issus de la lignée U87 shCHI3L1, les CSM semblent adopter une morphologie différente des
cellules contrôles, proche des cellules gliales. En revanche, les exosomes issus de cette même lignée cultivée en milieu défini, entraînent l’acquisition d’une
morphologie de type sénescent ou plus différenciée similaire à ce que l’on observe au sein d’une population de CSM à passage tardif in vitro. Les changements
morphologiques observés au sein des BM-MSC pourraient être dépendants de la proportion de CSC présentes, dans les lignées cellulaires de GBM. Ces données seraient en accord avec une étude montrant le tropisme des CSM pour les cellules souches gliales (Liu et al., 2014).
Les BM-MSC traitées avec des exosomes U87-MG irradiés semblent adopter la même morphologie que celle induite par les exosomes U87 shCHI3L1 en milieu défini, ce qui corrobore l’idée que les cellules de GBM en situation de stress, modifient l’information contenue dans les exosomes. D’autre part, la culture des U87 -MG en milieu défini permettrait l’émergence de clones cellulaires radiorésistants, les
CSCs (Bao et al., 2006). Les exosomes issus de ces clones pourraient favoriser l’émergence d’une population mixte au sein des CSM lors du traitement. Enfin, nos résultats montrent que des exosomes issus de lignées U87 shCHI3L1 ayant subi une
Sandra Pinet | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2016 198 irradiation semblent altérer la viabilité des CSM suggérant ainsi que la perte du caractère cellules souches cancéreuses via l’inactivation de CHI3L1 pourraient modifier le contenu des exosomes.
Etant donné le rôle clé du gène CHI3L1 dans le GBM, responsable du maintien du phénotype agressif, de l’acquisition du caractère infiltrant, de la radiorésistance, et dans l’angiogenèse tumorale (Cheray et al., 2011; Francescone et al., 2011b), son inactivation pourrait avoir un rôle direct sur le contrôle du microenvironnement en raison des modifications du contenu des exosomes (article 1).
Devant l’impact des exosomes de GBM sur la morphologie cellulaire, une analyse plus approfondie portant sur des marqueurs protéiques a été réalisé afin de caractériser ces modifications phénotypiques.
Les premiers marqueurs étudiés sont sont courrament exprimés par les CSM: CD44 et la N-cadhérine. L’expression de CD44 diminue dans les BM-MSC traitées par des exosomes issus de la lignée parentale U87-MGsuggérant une perte de l’état souche et donc un engagement vers une voie de différenciation. La N-cadhérine est également considérée comme un marqueur de la transition épithélio-mésenchymateuse dans les carcinomes (Smith et al., 2013). L’ajout d’exosomes tumoraux sur les BM-MSC ne modifie cependant pas l’expression de la N-cadhérine. Quelle que soient les conditions, les exosomes de GBM induisent l’expression de l’alpha-SMA. Cette expression est plus importante dans les CSM traitées aux exosomes de la lignée contrôle ou enrichies en CSC. Etant donné que l’alpha-SMA est exprimée par des cellules de type myofibroblastique et les CAF (Carcinoma Associated Fibroblastes) (Chowdhury et al., 2015; Haga et al., 2015), l’augmentation de son expression à la suite du traitement par les exosomes suggère une différenciation des CSM en cellules stromales de type CAF. De la même manière, une induction de l’expression de la GFAP est observée après traitement aux exosomes et plus particulièrement dans la condition milieu défini ce qui semble en accord avec les modifications morphologiques observées et agrémentent la piste d’une différenciation des CSM en cellules gliales.
Il est difficile de répondre quant aux variations des niveaux d’expression de l’EGFR
qui semble cependant plus élevés lorsque les CSM ont été exposées aux exosomes de GBM.
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L’expression de Runx2, facteur de transcription de la lignée ostéoblastique, se
retrouve augmentée suite aux traitements. De façon intéressante, il a été associé à
la transformation oncogénique dans le cas du mélanome (Boregowda et al., 2014). D’autre part, dans des tumeurs primaires de GBM, l’expression de Runx2 ainsi que
celle de la galectine-3 semble associé au caractère malin de ces cellules
(Vladimirova et al., 2008).
Enfin, des résultats préliminaires montrent que l’impact fonctionnel des
exosomes sur les BM-MSC semble différent selon l’état d’activation des cellules productrices d’exosomes. Les exosomes issus de cellules U87-MG favorisent la survie et la prolifération des CSM alors qu’ils n’influencent pas la migration. A l’inverse, la perte du caractère indifférencié des cellules U87-MG ou l’induction d’un
stress cellulaire; la radiothérapie conduit les cellules à produire des exosomes ayant
un fort pouvoir chimio attractant sur les CSM. Les différences observées en terme de survie, prolifération et migration des CSM pourraient s’expliquer par une modification du contenu des exosomes suite à l’inactivation de CHI3L1 et à l’application de radiations ionisantes sur les cellules de GBM. En effet, nos travaux précédents
confirment une modification du contenu des exosomes, notamment en récepteurs aux neurotrophines, après perte du caractère indifférencié suite à l’inactivation de CHI3L1 (article 1). D’autre part, après stress cellulaire hypoxique, les cellules de GBM sécrètent des exosomes qui reflètent et véhiculent ce statut hypoxique et qui ont un impact direct sur la vascularisation tumorale (Vladimirova et al., 2008) . Les exosomes issus des cellules de GBM semblent engagés les CSM dans un processus de différenciation. Cela renforce les données de la littérature où de nombreux travaux démontrent l’importance du recrutement de CSM au niveau du site tumoral afin de
les contrôler. Ceci permettrait alors aux CSM de sécréter des exosomes et des
facteurs de croissance nécessaires pour l’invasion et l’angiogenèse tumorale. Il serait
alors pertinent de déterminer et d’analyser la fonction des facteurs produits, par les CSM préalablement traitées par les exosomes, sur les cellules de glioblastome. Dans ce but, la sécrétion du NGF et du BDNF sera alors dans un premier temps recherché. Pour la suite de ce travail, d’autres lignées de GBM sont utilisées telle que la lignée LN-18 et les lignées MO59K et M059J respectivement radiorésistantes et radiosensibles. Deux autres lignées de CSM sont également utilisées, la lignée