La problématique de cette thèse était d’élaborer un système in vitro pour suivre en continu par
spectroscopie d’impédance électrique (EIS) l’infection de cultures cellulaires par le protozoaire parasite de genre Cryptosporidium. Ces dernières servent donc d’intermédiaires pour obtenir des informations comme
l’infectivité du parasite et potentiellement sur son cycle de vie.
Nous avions choisi comme modèle de cellules-hôte la lignée HCT-8 (issues d’un adénocarcinome iléocæcal humain) et comme modèle de parasite l’espèce Cryptosporidium parvum (C. parvum).
6.1.1 Avant l’introduction des parasites de C. parvum
La première étape consistait à concevoir un dispositif de mesure d’impédance électrique, composé de quatre puits de culture indépendants en polydiméthylsiloxane (PDMS) au fond desquels se trouve un Réseau d’Electrodes Interdigitées Planaires (REIP). Ce dispositif a été intégré à un banc de test expérimental, qui nous a permis de contrôler les paramètres suivants : tension d’excitation de 10mV, fréquences entre 100Hz et 1MHz, mesures sur cette gamme de fréquence sur 4 puits successivement, 7min d’écart entre deux mesures sur un même puits. Nous avons caractérisé notre dispositif de mesure et le banc de test avec différents liquides. Ceux-ci sont adaptés à la mesure de liquides dont la conductivité n’excède pas une certaine valeur. Dans le cas de liquides de conductivité élevée, comme le milieu de culture utilisé pour les cellules HCT-8, il s’avère que des effets parasites provenant des câbles du banc de test deviennent non négligeables à partir de 300kHz. Ceci est dû à la géométrie du REIP du dispositif de mesure, qui induit une valeur de constante de cellule faible.
En revanche, nous avons montré que notre dispositif est adapté pour mesurer pendant 76h l’impédance d’un tapis de cellules HCT-8 durant sa croissance jusqu’à confluence. En effet, la conductivité équivalente du tapis cellulaire est à partir de 3h inférieure à la conductivité maximale que notre système peut mesurer. Les expériences sur les cellules ont nécessité la mise en place d’un protocole qui nous a permis de supprimer les problèmes liés à la culture de cellule dans un faible volume de liquides (90µl) et de valider chaque mesure effectuée :
• La fuite du milieu a pu être évitée en collant les puits de PDMS sur le substrat avec des forces électrodynamiques.
• L’évaporation du milieu a été empêchée en recouvrant les puits d’un capot.
• Les contaminations bactériennes ont été évitées en filtrant chaque solution avant utilisation. Puis leur élimination a été confirmée par un contrôle systématique des surnageants sur de la gélose pour dénombrement (PCA).
D’un point de vue fréquentiel, les variations de la réponse induites par la croissance du tapis cellulaire sont visibles à des fréquences comprises entre 1kHz et 100kHz, donc inférieures à la fréquence où l’effet parasite des câbles est non négligeable (i.e. 300kHz). Plus précisément, nous avons défini une fréquence fS à laquelle notre système est le plus sensible à ces variations. A cette fréquence, l’évolution temporelle de la réponse impédimétrique comprend les 3 mêmes étapes qu’une courbe de comptage de cellules réalisée classiquement en biologie pendant une croissance cellulaire : une phase de stabilisation ; une phase de
se forment ; une phase de confluence, où les cellules recouvrent la totalité des REIP. Une modélisation de notre signal par circuit équivalent nous a montré que les deux dernières étapes sont également visibles dans l’évolution de l’élément correspondant au trajet paracellulaire du tapis de cellules, i.e. une résistance électrique. Ce paramètre est donc le plus adapté pour illustrer l’évolution temporelle de la réponse impédimétrique.
Cependant, nous avons vu que ces étapes dans l’évolution temporelle de la réponse impédimétrique dépendent du nombre de repiquage que les cellules HCT-8 ont subi au préalable. Celui-ci va notamment influencer la structure et le développement des jonctions intercellulaires. En conséquence, nous n’avons pas pu constater aux mêmes instants la phase de croissance exponentielle précédemment décrites. La reproductibilité de l’aspect de la réponse impédimétrique dépend donc du nombre de repiquages subis par les cellules. En outre, augmenter le nombre de repiquages a pour effet de diminuer l’amplitude de la réponse impédimétrique après 24h de croissance. Nous avons défini la sensibilité maximale de notre système comme étant le rapport entre le maximum et le minimum de l’amplitude de la réponse impédimétrique à la fréquence fS. Les effets de l’infection par le C. parvum sur l’impédance de cultures HCT-8 étant inconnus, nous avons choisi arbitrairement une limite basse de cette sensibilité, à savoir 2. Les expériences d’infection par le C. parvum ne sont pas effectuées sur les cultures présentant une
sensibilité inférieure à cette valeur. Notre modèle nous a montré que cette sensibilité était atteinte pour un nombre maximum de 18 repiquages sur une même culture de cellules.
6.1.2 Après l’introduction des parasites de C. parvum
Cette sensibilité minimale nous semblait nécessaire pour observer pendant 60h l’effet de l’infection par le parasite C. parvum sur la réponse impédimétrique de ces cultures HCT-8 à confluence. Un soin
particulier a été accordé au protocole de désenkystement et à la préparation du témoin :
• D’un côté, avoir un protocole de désenkystement efficace permet d’augmenter nos chances d’infection par oocyste de C. parvum introduit. Notre protocole a été validé par des tests de
désenkystement, qui nous ont permis de n’introduire que des inocula dont le taux de désenkystement est supérieur à 70%.
• D’un autre côté, le témoin négatif nous permet de nous assurer que la réponse observée lors de l’introduction d’un inoculum avec des parasites viables (et potentiellement infectieux) est bien due à cette infection. Geler les oocystes à l’azote liquide puis les ramener à 37°C permet de s’assurer d’une part que les oocystes sont morts et d’autre part que la réponse du témoin négatif n’est pas due à une température de l’inoculum inférieure à 37°C.
Nous avons observé pendant ces 60h une nette différence entre l’inoculum supposé infectieux et le témoin. L’infection a donc bien eu lieu. Ceci valide le fait qu’en suivant notre protocole, des oocystes atteignent le tapis cellulaire et ont encore suffisamment d’énergie pour infecter les cellules.
La réponse impédimétrique des cellules exposées à l’inoculum supposée infectieux est composée de 3 domaines temporels reproductibles à chaque expérience, pour des fréquences entre 1 et 100kHz (où les changements de la réponse impédimétrique induits par le tapis cellulaire sont visibles) :
• Le 1er : jusqu’à 9h PI (PI = post infection), pas de différence significative avec le témoin. • Le 2e : alternance entre 3 pics et 3 minima.
• Le 3e : chute de la réponse, le début étant dépendant de la fréquence appliquée.
Afin d’apporter des explications biologiques à cette réponse spécifique, nous avons observé en parallèle et à des moments spécifiques de ces domaines temporels le cycle de vie du parasite C. parvum. Celui-ci est
notamment caractérisé par des formes de reproduction asexuée et sexuée. Le recouvrement du tapis cellulaire par rapport à la surface de culture totale a également été déterminé:
• Les pics et minima observés dans le 2e domaine correspondent respectivement à une prédominance dans le total des formes de développement observées de zoïtes (i.e. formes invasives) et mérontes (i.e. formes prolifératives). Toutes deux correspondent à des formes de reproduction asexuée. Pendant le 2e domaine temporel, le recouvrement du tapis cellulaire est maximal, i.e. à confluence. Dans le même temps, les pics et minima observés dans la réponse impédimétrique sont également présents dans l’évolution des valeurs de la résistance modélisant le trajet paracellulaire. En nous basant sur des études récentes, nous avons émis l’hypothèse que ces variations sont une conséquence de l’invasion du parasite et de la réponse des cellules hôtes, qui induisent respectivement une perturbation et un renforcement des jonctions serrées.
• Dans le 3e domaine temporel, le nombre de parasites atteint un maximum. Nous pouvons également y observer l’apparition puis la prédominance de formes de type gamontes à la fin de l’expérience. Dans le même temps, nous avons pu observer une diminution du recouvrement du tapis cellulaire, impliquant une dégradation des cellules-hôtes. Nous avons ainsi pu fournir l’hypothèse que la dégradation des cellules-hôtes induite par l’apparition de formes de développement avancées du C. parvum implique une diminution de la réponse impédimétrique
du tapis cellulaire.
Pour finir, notre système a été testé comme capteur d’infectivité. Nous avons introduit sur des cultures HCT-8 confluentes des inocula de différents ratios de viabilité, que nous avons postulés d’infectivité différente. En nous plaçant à la fréquence fS de sensibilité maximale, notre système permet de les différencier. D’un côté, nous avons montré qu’il existe une relation linéaire liant l’amplitude des deux premiers pics du 2e domaine temporel et la dose infectieuse de l’inoculum introduit. D’un autre côté, le début du 3e domaine temporel dépend également de la dose infectieuse : plus celle-ci est élevée, plus le 3e domaine temporel début tôt.
En conclusion, il s’agit du premier travail permettant de mesurer en continu par spectroscopie d’impédance électrique l’infection de cultures de cellules par un protozoaire parasite. Ceci nous permet de définir des temps d’échantillonnage pertinents pour effectuer des analyses biologiques complémentaires et obtenir des informations sur le cycle de vie du parasite ainsi que sur la relation hôte-parasite. En outre, ce système peut être utilisé comme capteur d’infectivité, délivrant une réponse au moins 4 fois plus rapide que les techniques actuelles.