3.2.1 Réseau d’Electrodes Interdigitées Planaires (REIP)
Un Réseau d’Electrodes Interdigitées Planaires (REIP) est une structure composée d’un nombre N
d’électrodes en forme de bande (ou doigt) de taille micrométrique disposées parallèlement les unes par rapport aux autres (cf figure 3.2 et figure 3.3a). Ehret fut le premier à utiliser cette géométrie d’électrode pour mesurer l’impédance électrique de cultures cellulaires (Ehret et al., 1997). Leur intérêt réside dans le
fait que leur géométrie détermine la hauteur et la répartition du champ électrique induit, permettant d’ajuster la surface et l’épaisseur sondées dans le matériau sous test (ici le tapis cellulaire). Il faut noter que cette assertion est vraie si la hauteur de l’électrolyte est considérée comme infinie. Dans notre cas, nous souhaitons effectuer des mesures sur un tapis de cellules épithéliales de type HCT-8. Ce tapis s’apparente à une couche anisotrope (Grimnes et Martinsen, 2000) d’une hauteur de quelques micromètres (entre 5 et 10µm environ pour les cellules épithéliales (Van Driessche et al., 1993; Xiaoqiu Huang et al., 2004)) située
sur les électrodes (voir figure 3.2). Par conséquent, la géométrie de nos électrodes a été choisie en fonction de ces critères.
Figure 3.2 : Représentation d’un tapis cellulaire et du volume de l’électrolyte au-dessus des électrodes. Les cellules représentent une couche anisotrope de 5 à 10µm de hauteur et la hauteur de l’électrolyte peut être
considérée comme infinie par rapport à elle. Les dimensions ne sont pas à l’échelle.
Tout d’abord, afin de pouvoir sonder un tapis cellulaire de 5 à 10µm de hauteur, nous souhaitons que nos REIP induisent un champ dont la majorité de l’énergie électrique est comprise dans cette couche. Linderholm définit la profondeur de champ PC comme étant la hauteur à laquelle l’intensité du champ électrique est divisée par deux (Linderholm, 2006). En considérant comme infinies la longueur des doigts d’électrode et la hauteur de l’électrolyte, la profondeur de champ dépend de deux paramètres : la largeur des électrodes (Lel) et l’espacement entre les doigts (Eel). Pour notre géométrie d’électrodes, Lel et Eel sont en moyenne de 100µm et de 7µm respectivement. La profondeur de champ PC peut être calculée à partir
𝑃𝐶 =𝐿𝑒𝑒+ 𝐸2 𝑒𝑒�−1 − � 𝐿𝐿 𝑒𝑒 𝑒𝑒+ 𝐸𝑒𝑒� 2 + 2�1 − �𝐿 𝐿𝑒𝑒 𝑒𝑒+ 𝐸𝑒𝑒� 2 + �𝐿 𝐿𝑒𝑒 𝑒𝑒+ 𝐸𝑒𝑒� 4 (3.1)
Ce modèle nous donne une profondeur de champ de 6,04841µm. Nous pouvons donc supposer qu’une majorité du champ sera comprise dans le tapis cellulaire.
Par ailleurs, nous souhaitons prendre en compte le caractère anisotrope du tapis grâce à deux critères. Le premier concerne la forme des doigts de nos électrodes, qui ne sont pas rectilignes mais composés de disques disposés les uns à côté des autres. Comme le montre la figure 3.3b, le champ électrique induit par de tels doigts d’électrodes possède des lignes de champ également anisotropes, permettant de sonder le tapis dans de multiples directions, contrairement au cas d’électrodes rectilignes, dont les lignes de champ induites ne permettent de sonder qu’une seule direction dans le tapis (figure 3.3a). Nous avons aussi pris en compte le fait que ce caractère anisotrope doit être considéré sur l’ensemble du tapis. Nous avons donc augmenté le nombre de doigts que notre réseau comprend afin de sonder la totalité des cellules.
Figure 3.3 : Vue des dessus des lignes de champ induites par des électrodes interdigitées. a) Lorsque les formes des doigts sont rectilignes, les lignes de champ sont parallèles les unes par rapport aux autres. b) Lorsque les doigts sont composés de disques disposés les uns à côté des autres, les lignes de champ ne
sont plus parallèles, induisant une distribution anisotrope du champ électrique.
Nous avons considéré le fait que ces électrodes constituent une surface sur laquelle des cellules seront cultivées au fond d’un puits. Les matériaux choisis pour les électrodes et le substrat sont donc déterminants quant au succès de la croissance de ces cellules. Nous avons ainsi choisi de fabriquer nos électrodes en or car nous souhaitons les considérer comme idéalement polarisables. Comme nous l’avons vu précédemment (cf. 2.4.4.1), cela nous permettra de négliger les échanges chimiques entre l’électrode et l’électrolyte, tels que des réactions d’oxydo-réduction, et donc de possibles courant faradiques. Nos mesures s’effectuent à 10mV tandis que le potentiel redox de l’or est d’environ 1,5V, ce qui nous permet de valider le fait qu’elles peuvent être considérées comme idéalement polarisables. Quant au substrat, nous avons choisi le Pyrex car des mesures d’impédance électriques sur des cellules ont déjà été réalisées avec succès dessus, confirmant son caractère biocompatible dans notre cas de figure (Böhm et al., 2000). Enfin,
3.2.2 Puits
Le calcul de la constante de cellule (cf. 2.4.2.1) est basé sur l’hypothèse que la hauteur du milieu de culture est infinie par rapport aux dimensions des électrodes et à la profondeur de champ (Linderholm, 2006). Afin de satisfaire cette hypothèse, nous avons choisi de créer des puits de culture de 5mm de hauteur. Par ailleurs, nous souhaitons que toutes les cellules soient comprises dans le champ électrique induit par les électrodes. C’est pourquoi le diamètre du puits (6mm) est inférieur au diamètre du réseau circulaire d’électrodes (8mm). Le volume du puits, de forme cylindrique, est donc de 141mm3 (ou µl) environ.
En ce qui concerne le matériau constituant les puits, nous avons choisi le polydiméthylsiloxane (PDMS) car il s’agit d’un polymère aisément structurable. Néanmoins, le PDMS possède des limitations dans le cadre de cultures cellulaires. Parmi celles-ci, nous pouvons noter qu’il est perméable à l’eau, ce qui induit des problèmes d’évaporation du milieu de culture, et relativement toxique pour les cellules (Berthier
et al., 2012). Il est donc nécessaire de vérifier si la structure de PDMS a un impact significatif sur la
croissance cellulaire.
3.2.3 Dispositif de mesure
Afin de confirmer la reproductibilité de nos mesures d’impédance électrique sur des cultures cellulaires, nous avons choisi de répéter chaque expérience trois fois. Il est donc dans notre intérêt que le dispositif de mesure possède plusieurs puits de culture au fond desquels se trouvent des REIP distincts les uns des autres, permettant des mesures indépendantes. Cependant, si ces puits se trouvent trop proches les uns des autres, les risques de fuite de milieu de culture sous le PDMS d’un puits à un autre augmentent. Afin de conserver une distance suffisante entre les puits, nous avons décidé de concevoir quatre puits et donc quatre REIP. Nous sommes néanmoins conscients qu’une optimisation de l’espace permettant d’ajouter plus de zones de culture est possible.
Au final, le dispositif de mesure possède quatre électrodes de travail, chacune d’elle partageant une contre-électrode commune (figure 3.1a). Chaque REIP contient donc une électrode de travail et une contre-électrode, chacune d’elle possédant 37 doigts si nous considérons le réseau dans son ensemble ou 27 si nous considérons les doigts à l’intérieur du puits