Approche optique : Résonance de Plasmons de Surface (SPR)

 _{Description et application aux cultures cellulaires}

L’approche optique la plus utilisée pour suivre en continu et de manière non-invasive l’évolution morphologique d’un tapis cellulaire est basée sur la Résonance de Plasmons de Surface (SPR). L’objectif de cette technique consiste à étudier l’interface entre une surface solide conductrice (ex : électrode d’or) et un matériau déposé à sa surface (ex : tapis cellulaire) ou un milieu liquide (ex : milieu de culture) à l’aide de plasmons de surface.

Les plasmons sont des ondes électriques évanescentes produites par l’interaction de photons émis par une source lumineuse avec des électrons libres d’une surface conductrice. Cet effet peut être comparé aux ondes créées dans l’eau après avoir déposé une bouée à sa surface, ondes qui s’atténuent avec la distance. La configuration des capteurs SPR la plus utilisée est la configuration Kretschmann (figure 1.8), du scientifique du même nom (Kretschmann, 1971). Celle-ci consiste à monter un prisme sous une surface conductrice et de l’éclairer avec une source lumineuse à un angle incident θi. Cet angle doit être égal ou plus grand que l’angle de réflexion interne totale du prisme afin que toute la lumière soit réfléchie et qu’aucune portion ne soit transmise à travers la surface d’or. Cette réflexion induit la création de plasmons, i.e. un champ électrique évanescent le long de la surface d’or, qui provoque en conséquence la

diminution de l’intensité du rayon réfléchi à un angle appelé « angle de résonance plasmonique ». Lorsqu’une fine couche d’un matériau est adsorbée sur la surface, l’angle de résonance plasmonique et donc la réflectivité s’en trouveront modifiés, permettant ainsi de la caractériser.

Figure 1.8 : Illustration d’un biocapteur SPR. a) Configuration de Kretschmann d’un capteur SPR appliqué à l’analyse d’un tapis cellulaire. Les plasmons sont créés suite à l’excitation d’électrons de la surface d’or par les photons de la source lumineuse et la lumière réfléchie est captée par un photodétecteur. Une partie

de la lumière incidente est donc absorbée à un certain angle appelé « angle de résonance plasmonique », qui varie avec la présence (pointillés) ou non (traits pleins) de cellules. b) Evolution de la réflectivité captée

par le photodétecteur en fonction de l’angle d’incidence de la source lumineuse. Le minimum observé correspond à l’angle de résonance plasmonique, qui varie suivant la présence (pointillés) ou non (traits

pleins) des cellules. c) Evolution temporelle de la réflectivité à angle incident fixe.

Cette technique a depuis longtemps été utilisée pour étudier des interactions biomoléculaires, à propos desquelles plus d’informations peuvent être obtenues dans la revue de Homola et al. (Homola et al., 1999).

Son application à l’analyse de cultures cellulaires reste cependant récente (Robelek, 2009). Cette technique est particulièrement adaptée à leur étude car elle est non-invasive et ne nécessitent pas de marquage. De plus, il est possible de suivre en continu avec une haute résolution temporelle l’évolution de l’angle de résonance plasmonique (Yanase et al., 2007b) et donc des phénomènes relatifs aux cellules. Elle est donc

adaptée pour suivre l’évolution de tapis cellulaires sur une longue durée.

 _Avantages

L’avantage principal de cette technique quant au suivi continu et non-invasif de la morphologie d’un tapis cellulaire est qu’elle peut apporter deux types d’information : temporelle et angulaire. Il est en effet possible d’étudier la réflectivité soit à une longueur d’onde constante et un angle d’incidence variable, soit à un angle d’incidence constant avec une source polychromatique sur une longue durée (Knoll, 1998). Cette réflectivité recouvre tous les phénomènes influençant le champ électrique évanescent induit par la réflexion de la lumière incidente. Ainsi, Yanase et al. ont montré une corrélation entre la force du signal

SPR et la surface couverte par les cellules (Yanase et al., 2007b) et ont étudié les différents phénomènes

D’un point de vue spatial, il est possible d’étudier latéralement les différences de réflectivité et de convertir les images au microscope. Giebel et al. ont ainsi pu déduire la distance moyenne entre les

différentes parties de cellules gliales de poisson et la surface de l’électrode (Giebel et al., 1999). Le suivi

temporel peut ainsi être combiné avec un suivi optique.

Enfin, il existe des systèmes commerciaux, comme le Biacore T200 commercialisé par la société du même nom, compatibles avec des systèmes comprenant 96 ou 384 puits de culture. Ceci montre que les possibilités de parallélisation existent et seront vraisemblablement amenées à se développer en vue d’applications au criblage haut-débit.

 _{Inconvénients}

Néanmoins, tout comme l’approche par QCM, le principal défaut des analyses SPR réside dans la faible hauteur de pénétration du champ évanescent lorsque la longueur d’onde de la source lumineuse utilisée est dans la lumière visible, ce qui est le cas de la plupart des systèmes. La profondeur de champ est en effet dans ces conditions d’environ 200nm (Steyer et Almers, 2001). Or, à cette distance, seulement la lame basale inférieure de la cellule est sondée. Certes, des informations relatives par exemple à l’interaction entre la surface et la cellule, aux changements au niveau de la surface d’adhésion voire sur le cytosquelette peuvent en être extraites (Fang, 2006; Robelek et Wegener, 2010). Cependant, aucune information ne peut être obtenue sur la morphologie du tapis au niveau de la zone apicale.

Golosovsky et al. ont proposé de pallier cet inconvénient en remplaçant la source lumineuse dans le

domaine du visible par des rayonnements infra-rouges (Golosovsky et al., 2009). La profondeur de

pénétration du champ évanescent étant proportionnelle à la longueur d’onde du rayonnement incident, utiliser un rayonnement infrarouge permet de la faire augmenter jusqu’à 2,5µm. Ils ont ainsi accédé à des informations invisibles avec la méthode précédente, par exemple des différences de réponse indiquant plusieurs phases dans l’adhésion cellulaire (contact intial entre les cellules et le substrat, étalement des cellules, formation de contacts intercellulaires et génération d’amas de cellules). Malgré tout, les cellules épithéliales étant d’une hauteur comprise entre 5 et 10µm environ (Van Driessche et al., 1993; Xiaoqiu

Huang et al., 2004), certains phénomènes apparaissant au niveau de la zone apicale demeurent

transparents.

Enfin, la réflectivité est un paramètre intégral, reflétant la contribution de nombreux phénomènes. Ceux-ci sont, par cette approche, difficiles à différencier, compliquant ainsi l’interprétation des résultats.