Réacteur Couette-Taylor

Ce système, fabriqué à notre demande par la firme Synthecon (USA), a été conçu pour la culture en mode perfusé des cellules animales sous contraintes hydrodynamiques contrôlées. Dans le cadre de nos travaux, seuls sa conception et son dimensionnement seront détaillés dans le dernier chapitre de la partie résultats.

B. Outils analytiques

Le suivi cinétique des cultures en suspension a été réalisé à partir d’échantillons prélevés toutes les 12 heures environ. Leur traitement est décrit dans la Figure II-4.

l’IFNγ: Quantification (ELISA)

Glycosylation(Western-blot)

Glucose Lactate Glutamine Ions ammonium

Echantillons au cours du temps

Surnageant de culture Numération (cellule de Thoma)

Viabilité (Bleu Trypan)

Cellules viables, X_v Cellules bleues, X_b LDH Cellules lysées, X_l Centrifugation (5min,800 rpm) Culot Cellulaire Dosage caspase 3 * Electrophorèse 2D * Apoptose

Profil des protéines de stress

*L’analyse des caspases 3 et l’électrophorèse 2D n’ont été effectués que pour les cultures en spinner (10 à 15 ml) (1 ml)

l’IFNγ: Quantification (ELISA)

Glycosylation(Western-blot)

Glucose Lactate Glutamine Ions ammonium

Echantillons au cours du temps

Surnageant de culture Numération (cellule de Thoma)

Viabilité (Bleu Trypan)

Cellules viables, X_v Cellules bleues, X_b LDH Cellules lysées, X_l Centrifugation (5min,800 rpm) Culot Cellulaire Dosage caspase 3 * Electrophorèse 2D * Apoptose

Profil des protéines de stress

*L’analyse des caspases 3 et l’électrophorèse 2D n’ont été effectués que pour les cultures en spinner (10 à 15 ml) (1 ml)

LDH

Diaphorase

B.1. Dosages des principaux métabolites cellulaires

Les dosages de la LDH, du glucose, du lactate et de la glutamine ont été effectués initialement avec des kits enzymatiques en plaques 96 puits à l’aide d’un spectrophotomètre à plaques (Titertek Multiskan MCC/340, Flow Laboratories). Suite à l’achat d’un automate de laboratoire Vitalab Selectra E (Vital Scientific), la mise au point de ces dosages a été réalisée sur cet appareil afin de permettre des mesures plus rapides et plus précises.

B.1.1. Dosage de la LDH

Le dosage de la LDH dans les surnageants de culture ainsi que la détermination du contenu intra-cellulaire en LDH des CHO 320 ont été effectués en plaques 96 puits avec le kit enzymatique Cytotoxicity Detection Kit (réf. 1644793, Roche) selon le principe suivant : Lactate + NAD⁺ Pyruvate + NADH + H⁺ (II-1) Tétrazolium (jaune) + NADH + H⁺ Formazan (rouge) (II-2) L’augmentation de la quantité de formazan est donc corrélée avec une augmentation de l’activité lactico-déshydrogénase. L’intensité de la coloration rouge est mesurée à 500 nm. L’erreur de mesure est d’environ 15%.

Le dosage de la LDH avec l’automate de laboratoire est réalisé à l’aide du kit enzymatique LDH PAP (réf. LDSL-0420, Elitech). La LDH, présente dans l’échantillon, convertit le pyruvate en lactate en présence de NADH,H⁺ selon la réaction suivante :

Pyruvate + NADH + H⁺ Lactate + NAD⁺ (II-3) La disparition de NADH est mesurée à 340 nm, et l’erreur de mesure par cette méthode est inférieure à 7%.

Le contenu intracellulaire en LDH a été determiné à partir de cellules vivantes resuspendues dans une solution de lyse (Tween-20 à 2 % dans le PBS). Le contenu cellulaire de LDH déterminé pour les cellules CHO 320 en milieu PF-BDM est de 6,8 UI LDH/10⁷ cellules.

Glucose oxydase

Peroxydase

B.1.2. Dosage du glucose

Le dosage du glucose en plaque 96 puits a été effectué avec le kit enzymatique GAGO-20 (réf.510-A, Sigma) selon les réactions enzymatiques suivantes :

Glucose + H2O + O2 Acide gluconique + H2O2 (II-4) H2O2 + ο-dianisidine réduite ο-dianisidine oxydée (II-5)

(couleur brune)

ο-dianisidine oxydée ο-dianisidine oxydée (II-6)

(couleur brune) (couleur rose)

La troisième réaction permet uniquement d’avoir une coloration plus stable. L’intensité de la coloration rose, mesurée à 540 nm, est proportionnelle à la concentration de glucose dans l’échantillon. L’erreur de mesure est inférieure à 10 %.

Le glucose est dosé avec l’automate de laboratoire à l’aide du kit enzymatique Glucose PAP (réf. GPSL-0500). Le principe du dosage repose sur les réactions suivantes :

Glucose + O2 + H2O acide gluconique + H2O2 (II-7) 2 H2O2 + Phénol + amino-4-antipyrine Quinonéimine (II-8) L’apparition de quinonéimine est détectée à 500 nm. L’erreur de mesure par cette méthode est estimée à 4,6%.

B.1.3. Dosage du lactate

Le dosage du lactate en plaques 96 puits (L-Lactic acid, réf. 10 139 084, Roche) repose sur le principe suivant :

Lactate + NAD⁺ Pyruvate + NADH⁺ + H⁺ (II-9)

Pyruvate + glutamate alanine + 2-Oxoglutarate (II-10)

Peroxydase Glucose oxydase H2SO4 Glutamate Pyruvate Transaminase L-LDH

La deuxième réaction permet de déplacer la réaction de la LDH. L’augmentation d’absorbance à 340 nm, relative à l’augmentation de la quantité de NADH formée, est proportionnelle à la quantité de lactate présent dans l’échantillon. L’erreur de mesure est comprise entre 10 et 20%.

Le dosage du lactate avec l’automate de laboratoire est réalisé avec le kit Lactate-PAP (réf. 61192, Biomérieux). Le lactate est d’abord transformé en pyruvate et peroxyde d’hydrogène par la lactate oxydase :

Lactate + O2 Pyruvate + H2O2 (II-11) L’eau oxygénée formée est dosée selon la réaction suivante :

H2O2 + 4-amino-antipyrine+ 4-chlorophénol Quinonéimine+2 H2O2 +HCl (II-12) L’intensité de la coloration de quinonéimine proportionnelle à la quantité de lactate présente dans l’échantillon est mesurée à 446 nm. L’erreur de mesure est de 5%.

B.1.4. Dosage de la glutamine

Le dosage est basé sur le dosage enzymatique du glutamate, la glutamine étant préalablement transformée en glutamate à l’aide de l’enzyme asparaginase (réf. 102903, Roche) selon la réaction :

Glutamine + H2O glutamate + NH3 (II-13) Le dosage du glutamate est ensuite réalisé en utilisant un kit commercial (réf. 139092, Roche) avec les réactions suivantes :

Glutamate + NAD⁺ + H2O α-cétoglutarate + NADH + H⁺+ NH4⁺ (II-14) INT + NADH + H⁺ NAD⁺ + formazan (II-15) L’apparition du formazan est détectée à 492 nm (spectrophotomètre Multiskan MCC/340 Titertek). La concentration en glutamine est déterminée par différence, en dosant d’une part le

Peroxydase Lactate oxydase Asparaginase Diaphorase Glutamate déhydrogénase

glutamate seul, et d’autre part l’ensemble glutamate + glutamine après transformation par l’asparaginase. L’erreur de mesure est estimée à 20%.

Le dosage avec l’automate de laboratoire a été effectué avec un kit enzymatique (réf. 780000005, CellD) couplant la glutaminase, la L-glutamate oxydase et une peroxydase : Glutamine + H2O Glutamate + NH3 (II-16) Glutamate + O2 + H2O 2-oxoglutarate + NH3 + H2O2 (II-17) H2O2 + EHSPTF

* F

+ 4-amino-antipyrine quinine (II-18) La mesure de la DO s’effectue à 546 nm, et l’erreur de mesure est estimée à 5,5%.

B.1.5. Dosage des ions ammonium

Le dosage des ions ammonium est réalisé grâce à une électrode à diffusion gazeuse (Orion). En milieu fortement alcalin, les ions ammonium du milieu sont transformés en NH3 gazeux selon la réaction suivante :

NH4⁺ + OH^- NH3 + H2O (II-19) L'équilibre est déplacé vers la droite par addition de 3 ml de soude 0,5 N à 3 ml d'échantillon à analyser. Le pH final du mélange est d'environ 12. L'ammoniac formé diffuse à travers la membrane perméable de l'électrode et entraîne une variation du potentiel selon la loi de Nernst :

E = E0 –S.log [NH3] (II-20) où E0 est le potentiel de référence (ordonné à l'origine) et S est la pente de la courbe d'étalonnage. L'étalonnage est effectué avec des solutions de NH4Cl de molarité connue (de 0,5 à 20 mM) en traçant le logarithme de la concentration [NH4Cl] en fonction du potentiel de l'électrode (mV). L'erreur de dosage est inférieure à 10%.

* EHSP : N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfo-propyl)-3-methylalanine

Glutaminase

L-glutamate oxydase