Analyse de l’interféron gamma

B.2.1. Quantification de l’IFN-γ par test ELISA

La production de l’IFN-γ est déterminée par la méthode ELISA, à l'aide d'un kit commercial (réf. DY285, R&D SYSTEMS). L'anticorps polyclonal de souris dirigé contre L'IFN-γ humain recombinant est dilué dans une solution de PBS et fixé à température ambiante durant une nuit au fond d'une microplaque à 96 puits (Nunc, réf A1390177). Les puits sont ensuite rincés à l'aide d'un tampon de lavage (solution de PBS contenant 0,05% Tween 20 (vol/vol), pH 7,2-7,4). Les sites de fixation non occupés sont saturés durant une heure à l'aide d'un tampon de saturation (solution de PBS contenant 1% BSA m/vol (Sigma, réf. A7030) et 0,05% d’azide de sodium). Après 3 rinçages, les échantillons et les standards (IFN-γ humain recombinant dont les concentrations sont comprises entre 15,625 pg/ml et 1000 pg/ml) sont déposés dans ces puits pour une incubation de 2 heures. La microplaque est alors rincée trois fois avec le tampon de lavage avant de déposer l'anticorps de chèvre anti-IFN-γ conjugué à la biotine. L'ensemble est incubé pendant 2 heures. Après plusieurs rinçages, la peroxydase de radis noir (HRP) conjuguée à la streptavidine, est ajoutée au complexe anticorps-antigène précédemment formé pour une durée de 20 minutes. Après plusieurs lavages, le substrat de la peroxydase (mélange d'une solution d'H2O2 et d'une solution de tetraméthylbenzidine, ratio 1/1 vol/vol) est ajouté, puis l’ensemble est incubé pendant 20 minutes. La réaction est alors stoppée par ajout d'H2SO4 2 N et l'absorbance est mesurée à 450 nm sur le spectrophotomètre

Multiskan MCC/340 (Titertek) avec une correction de DO à 540 nm. Les échantillons à doser sont dilués au 1/500^e, 1/2000^e et 1/4000^e. L'erreur sur la mesure est de l'ordre de 10 %.

B.2.2. Caractérisation de la macrohétérogéneité de la glycosylation de l’IFN-γ L’hétérogénéité d’occupation des sites de glycosylation de l’IFN-γ humain recombinant est visualisée par western-blot chimioluminescent.

Electrophorèse des protéines (SDS-PAGE)

Les protéines présentes dans les échantillons sont d’abord séparées en fonction de leur taille sur un gel d’électrophorèse d’après la méthode de Kochanowski et al. (2008). Les protéines sont concentrées grâce à un gel d’acrylamide à 5%, puis séparées par un gel d’acrylamide à 11%. La composition du gel de concentration et du gel de séparation est présentée dans le Tableau II-2.

Les surnageants de culture sont concentrés sur des membranes de filtration présentant un seuil de coupure de 10 kDa (Nanosep 10K, Pall). Les concentrats sont récupérés et dilués au 1/3 dans du tampon de charge (4,8 ml H2O ;1,2 ml Tris-HCl 0,5 M pH6,8 ; 2 ml SDS 10% ; 5% de β-mercapto-éthanol ; 1 ml glycérol ; 0,5 ml bleu de bromophénol 5%). Ces échantillons sont ensuite chauffés à 100°C pendant 5 minutes, puis déposés sur un gel d’acrylamide à raison de 15 l maximum par puits. On dépose également sur le gel 5 l de marqueur de taille commercial précoloré (réf. SM 0671, MBI Fermentas) et 200 ng d’interféron-γ humain standard non glycosylé (réf. 285-IF, R&D Systems).

La migration effectuée avec l’appareil Mini-Protean II (Biorad) se déroule à intensité constante (25 mA/gel, tension limite 180 V) durant 1 heure environ dans le tampon de migration (glycine 14,4 g/L ; Tris-Base 3 g/L ; SDS 1 g/L).

Tableau II-2 : Composition des gels de concentration et de séparation.

Gel de concentration (5%) Gel de séparation (11%) Tris-HCl 1,5M pH 8,8 (ml) - 2,5 Tris-HCl 0,5M pH 6,8 (ml) 2,5 - H2O (ml) 5,6 3,6 Acrylamide-bisacrylamide 30% (ml) 1,7 3,7 SDS 10% ( l) 100 100 Persulfate d’ammonium ( l) 100 100 TEMED ( l) 10 10

Transfert des protéines sur membrane PVDF et immunomarquage

Dans un deuxième temps, les différentes protéines séparées sont transférées sur une membrane en fluorure de polyvinylidène (PVDF). L’interféron-γ humain recombinant est révélé spécifiquement par immunomarquage. La chimioluminescence a été choisie en raison de sa grande sensibilité, de l’ordre du nanogramme.

Le transfert est réalisé sur une membrane PVDF en milieu liquide sur l’appareillage Mini Trans-Blot Cell (Biorad). Avant le transfert, la membrane de PVDF (Hybond-P, réf. RPN 2020F, Amersham Biosciences) est incubée 15 minutes dans le méthanol. Les éponges et les papiers filtres Whatman sont imprégnés de tampon de transfert (Tris-Base 3 g/L; Glycine 14,4 g/L ; 20% méthanol vol/vol). Lorsque la migration des protéines est terminée, le gel est

incubé à son tour dans le tampon de transfert pendant 5 minutes. Le gel et la membrane sont mis en sandwich entre les éponges et les papiers filtres. Le schéma du montage est présenté sur la figure II-4. Le transfert se déroule pendant 20 minutes à tension constante (80 V-intensité limite 400 mA). Son efficacité est vérifiée grâce au marqueur de taille précoloré qui se transfère sur la membrane dans ces mêmes conditions.

La membrane est ensuite incubée dans plusieurs bains sous faible agitation. Elle est, dans un premier temps, saturée par une solution de saturation (lait écrémé 5% w/vl ; PBST : PBS contenant 0,05 % de Tween 20) durant 1,5 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4°C. Après trois lavages de 5 minutes chacun dans le PBST, la membrane est incubée pendant 1 h avec l’anticorps polyclonal de lapin anti-interféron-γ humain (réf. P-700, Endogen) dilué au 1/500 dans le tampon de réaction (solution de PBST contenant 0,5 % de lait écrémé w/v). A la suite de trois lavages de 5 minutes chacun dans le PBST, la membrane est incubée pendant 1 heure, avec l’anticorps secondaire de chèvre anti-lapin couplé à la HRP (réf. P0448, Dako), dilué au 1/4000 dans le tampon de réaction. Trois lavages de 5 minutes avec le PBST sont encore nécessaires avant d’effectuer la révélation.

⊕

⊕

Figure II-5 : Montage utilisé lors du transfert des protéines sur membrane PVDF

Révélation

La membrane est incubée 1 minute dans le mélange de substrat chimioluminescent (Kit ECL Plus, réf. RPN 2132, Amersham Biosciences). La membrane est ensuite positionnée dans un film de cellophane transparent placé dans une cassette. La suite de la manipulation se fait dans une chambre noire sous lumière rouge. Un film photosensible (Hyperfilm ECL 18x24 cm, réf. RPN 2103K, Amersham Biosciences) est mis en contact avec la membrane pendant 1 à 5

minutes. Le film ainsi impressionné est plongé dans le liquide révélateur, puis rincé à l’eau, plongé dans le liquide fixateur pendant 1 à 2 minutes, et enfin rincé à l’eau avant d’être séché. L’analyse densitométrique des films photosensibles est effectuée grâce à l’appareil Versadoc

(Biorad) et le logiciel Quantity One (Biorad). Cette analyse est réalisée par la mesure de l’intensité du signal, c'est-à-dire, par la mesure du nombre et de l’intensité des pixels supérieurs au bruit de fond préalablement déterminé.

B.3. Electrophorèse bidimensionnelle des protéines

L’analyse des profils électrophorétiques des cellules cultivées à différentes vitesses d’agitation est effectuée afin de visualiser une éventuelle expression de protéines de stress telles que les protéines chaperonnes ou de structure (HSP et cytosquelette).

Préparation des échantillons et hydratation de la bandelette d’isoélectrofocalisation

Après lavage des cellules au PBS, le culot cellulaire est lysé au sonicateur dans une solution de 10 mM de Tris-HCl (pH 6.8), 2% de BME, 1% de NP-40. Les aliquots d’un volume final de 300 µl avec 4 millions de cellules, sont passés au sonicateur dans la glace pour une durée de 2 mn (libération des protéines et des acides nucléiques). Les échantillons peuvent être congelés à -80°C. Après une centrifugation à 15000 rpm durant 10 minutes, le surnageant est séparé des débris puis les protéines sont dosées par la méthode de Bradford (Bradford, 1976). Pour hydrater une bandelette de 7 cm, une quantité de protéines comprise entre 150 et 300 µg par échantillon est nécessaire.

Les protéines sont précipitées à l’acétone froide (5 volumes, -20° C pendant 1 h) puis centrifugées à 15000 rpm durant 30 mn. Les précipités sont lavés avec un volume identique d’acétone froid, puis sont solubilisés dans une solution d’urée 9,8 M, CHAPS 5 % (w/v), bleu de bromophénol, DTT (5 mg pour 1 ml d’urée) et ampholyte (1 %) dans un volume final de 150 µl déposé sur la bandelette. Celle-ci est alors recouverte par 3 ml d’huile pour la nuit afin d’éviter l’évaporation.

Séparation des protéines selon le pI : Isoélectrofocalisation (IEF)

La bandelette, constituée d’un gel d’acrylamide sur un support plastique, est placée dans le bloc d’IEF dans le sens correspondant aux électrodes. 2 morceaux de papiers humidifiés à l’eau ultrapure sont appliqués sur les électrodes pour faire contact avec la bandelette. La

bandelette est recouverte d’1 ml d’huile minérale afin de limiter l’évaporation au cours de la migration qui s’effectue à 9000 V/h avec une intensité limite de 40 µA.

Equilibration : préparation des bandelettes avant migration sur gel SDS PAGE

Après l’étape d’isoélectrofocalisation, la bandelette est incubée, dans un premier temps, dans une solution contenant 6 M urée, 30 % glycérol, 2% SDS, 2% DTT, et 0,05 M de Tris-HCl (pH 6,8) durant 10 mn. Cette étape permet la réduction des ponts disulfures qui se sont formés au cours de l’isoélectrofocalisation. Enfin, les groupements thiols sont bloqués par incubation dans une solution contenant 6 M urée, 30 % glycérol, 2% SDS, 2,5% iodoacétamide, et 0,05 M de Tris-HCl (pH 6,8) durant 10 mn. Ces deux étapes sont réalisées sous agitation douce.