Milieu de culture

Classiquement, les cellules animales sont cultivées dans des milieux de base contenant une source carbonée, des acides aminés dont la glutamine, des éléments minéraux, des oligo-éléments, des vitamines, un système tampon et certains additifs comme le sérum de veau fœtal ou ses substituant. Ces milieux sont fabriqués soit sous forme liquide, concentrée ou prête à l’emploi, soit sous forme de poudre. Leurs principaux constituants sont présentés ci-dessous.

a) Milieux de base

Les milieux de base utilisés en culture cellulaire contiennent le plus souvent des éléments minéraux, des acides aminés et organiques, des vitamines, un tampon, un indicateur de pH et une source carbonée. Plusieurs milieux de base, élaborés il y a plus de 40 ans, sont disponibles (RPMI, MEM, DMEM, IMDM, Ham’s F12, etc…). Ils sont généralement complétés par l’ajout de divers composants tels que des lipides, des protéines, du sérum de veau fœtal (SVF), des acides aminées, des modulateurs de croissance ou de production, des cytokines, des antibiotiques, des nucléotides, des surfactants, etc…

b) Glucose

Le glucose constitue la principale source de carbone et d’énergie apportée aux cellules. Sa concentration physiologique sérique chez l’homme est de 5 mM. Dans les milieux de culture, il est présent à des concentrations comprises entre 5 et 25 mM. Ce sucre est métabolisé rapidement et peut être associé ou substitué par d’autres glucides métabolisés plus lentement, comme le maltose (Duval et al., 1992), le galactose (Altamirano et al., 2000; Wagner, 1990) ou le fructose (Bhuiyan et al., 2007; Dardenne et al., 1994).

c) Glutamine

Au niveau de sa concentration, la glutamine est le deuxième composant énergétique du milieu de culture. Sa concentration est 10 à 100 fois plus élevée que celle des autres acides aminés (0,5 à 5 mM). Elle représente une importante source de carbone et d’énergie pour les cellules animales en culture. Elle est nécessaire à la croissance cellulaire, et intervient également en tant que précurseur dans la biosynthèse des nucléotides puriques et pyrimidiques, des acides nucléiques et des acides aminés (Engström et Zetterberg, 1984). Elle sert également de composant régulateur lors de la réplication de l’ADN (Christie et al., 2001; Hyde et al., 2003). Il est important que le milieu de culture contienne de la glutamine, car les cellules animales (hybridomes et myélomes) sont soit dépourvues de glutamine synthétase, ou soit possèdent une activité insuffisante (cellules CHO et BHK) pour synthétiser la glutamine à partir d’ions ammonium et de glutamate (Neermann et Wagner, 1996).

d) Acides aminés

Les acides aminés sont les principaux pourvoyeurs d’azote, et sont impliqués dans la biosynthèse des protéines et des nucléotides chez les mammifères. Treize acides aminés sont dits essentiels pour les cultures de cellules animales. Il s’agit de l’arginine, la cystéine, la

glutamine, l’histidine, l’isoleucine, la leucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine et la valine. Les concentrations en acides aminés sont variables en fonction du milieu de culture considéré.

e) Lipides

Les lipides sont des éléments constitutifs des membranes cellulaires. Le cholestérol et les acides gras sont les composants lipidiques principaux des milieux de culture. Dans le cas de milieux sans sérum, il est indispensable de les ajouter pour assurer la croissance cellulaire (Castro et al., 1992). Certains acides gras essentiels, comme l’acide linoléique, ont un effet stimulateur sur la croissance cellulaire (Castro et al., 1995).

f) Vitamines et cofacteurs

Les vitamines sont des molécules organiques requises en faible quantité, qui ne peuvent pas être synthétisées et doivent donc entrer dans la composition du milieu de culture. Ce sont surtout des vitamines hydrosolubles : l’acide nicotinique (niacine) et le nicotinamide (vitamine PP), la thiamine (vitamine B1), la riboflavine (vitamine B2), l’acide pantothénique, la pyridoxine (vitamine B6), la biotine (vitamine H), la cobalamine (vitamine B12), l’acide folique et l’acide ascorbique (vitamine C). Ces vitamines interviennent en tant que coenzymes ou dans la composition des coenzymes. La vitamine C est également une substance anti-oxydante. Certains auteurs ont montré que les concentrations de certaines vitamines dans les milieux classiques pouvaient être insuffisantes et conduire à la limitation de la croissance cellulaire (Kurano et al., 1990b). De plus, la concentration d’une vitamine dans un milieu de culture est susceptible de modifier la vitesse de croissance cellulaire ainsi que la productivité (Hiller et al., 1994).

g) Nucléotides

Les nucléotides sont des molécules essentielles pour le métabolisme cellulaire. En effet, les nucléotides mono-, di-, et tri-phosphates (ATP, CTP, GTP et UTP) participent au maintien du métabolisme énergétique. Ce sont également des précurseurs des nucléotides-sucres, tels que l’UDP-Glc, l’UDP-Gal, l’UDP-GlcNac, l’UDP-GalNac, le GDP-Man, le GDP-Fuc, le CMP-NeuGc et le CMP-NeuAc. Outre leur rôle dans diverses voies métaboliques, les nucléotides sucres sont des molécules indispensables au bon déroulement du processus de glycosylation, car ce sont des substrats donneurs de résidus glucidiques dans les réactions enzymatiques se

déroulant dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. Enfin, les ribo- et déoxynucléotides participent à la synthèse de l’ADN et l’ARN.

h) Eléments minéraux

En fonction de leur nature, les ions inorganiques peuvent intervenir dans le maintien du pH et l’osmolarité du milieu, le transfert de molécules à travers les membranes et comme cofacteurs enzymatiques. Ces ions sont notamment le calcium, le magnésium, le phosphate, le potassium et le sodium. Les ions métalliques (Fer, Magnésium, Cuivre, Zinc…) sont apportés à l’état de traces par le milieu de culture, car ils sont essentiels à la croissance cellulaire, participent au site actif de certaines enzymes et interviennent dans les réactions de la chaîne respiratoire.

i) Le sérum de veau fœtal et les milieux sans sérum et sans protéines

Les milieux de base ne suffisent pas à couvrir seuls les besoins nutritifs de la cellule et un ajout de sérum de veau fœtal (SVF) de 5 à 20% (v/v) doit les compléter. Mis à part son rôle nutritif, le SVF a un effet tampon sur le milieu de culture, permet d’inhiber les protéases, et favorise l’attachement des cellules adhérentes. La composition du sérum est complexe et variable d’un lot à un autre. Il contient de fortes concentrations en protéines ce qui peut compliquer la purification de la protéine recombinante d’intérêt. Il comporte également des enzymes hydrolytiques. L’inconvénient majeur de l’utilisation du sérum est la présence potentielle d’agents infectieux pathogènes, notamment les prions. Ainsi se sont développés ces dernières années des milieux de culture sans sérum, voire dépourvus de protéines d’origine animale. La composition chimique de ces milieux est alors parfaitement définie et contrôlée. En général, le sérum est substitué par des protéines comme l’insuline, la transferrine, l’albumine et des lipides. Les hydrolysats végétaux se révèlent également être une alternative particulièrement intéressante (Chabanon et al., 2008; Deparis et al., 2003; Farges-Haddani et al., 2006; Farges et al., 2008; Mols et al., 2004).

A.2.2. Conditions physico-chimiques

La culture en bioréacteur nécessite le maintien des cellules dans des conditions optimales équivalentes à celles in vivo. Il est donc nécessaire d’assurer le suivi et la régulation de certains paramètres opératoires présentés ci-dessous.

a) Température

La température du milieu de culture doit être régulée de façon précise. La température optimale de croissance des cellules animales est de 37°C, mais la croissance reste satisfaisante pour des températures comprises entre 36,5 °C et 38°C (Ducommun et al., 2002). En deçà, la croissance est ralentie (Kurano et al., 1990a). A des températures trop élevées, ou trop faibles, les cellules génèrent des protéines de choc thermique (heat shock proteins) dont le rôle est d’adapter la cellule à cette élévation ou diminution de température (Jenkins et Hovey, 1993).

b) pH

Les cellules animales tolèrent de faibles variations de pH et doivent, par conséquent, être cultivées dans un milieu de culture dont le pH est compris entre 6,8 et 7,8 ; la valeur de pH optimale pour la croissance étant voisine de 7,2. Le milieu de culture est généralement tamponné par du bicarbonate de sodium. Au cours de la culture, les cellules peuvent produire de l’acide lactique en quantité importante. Le milieu de culture est alors maintenu à un pH proche de la neutralité par ajout de soude. La régulation du pH est essentielle car un pH inférieur à 7 peut provoquer une mort cellulaire importante (Goergen et al., 1993 ; Cherlet, 1995).

c) Oxygène dissous

L’oxygène est un élément essentiel pour la croissance des cellules animales. En effet sa consommation est généralement comprise entre 0,05 et 0,5 mmol O2/h/10⁹ cellules (Ruffieux et al., 1998). En bioréacteur, la surface de contact entre l’air et le ciel est trop faible pour assurer des échanges diffusionnels suffisants à l’interface air-liquide. C’est pourquoi, l’oxygène est apporté directement dans le milieu de culture, par exemple par un système de diffusion fritté. Ceci permet de maintenir la pression partielle en oxygène (pO2) à une valeur de consigne proche de 50% de la saturation en air. Si la pO2 est trop élevée, les cellules subissent un stress oxydant, et produisent des espèces oxygénées hyper-réactives et toxiques (anion superoxyde, peroxyde, radical hydroxyle).