Purifications d’Artemis

La protéine Cernunnos est exprimée en cellules d’insecte sf21 avec une étiquette 10His en Cter. Nous utilisons 4 culots de 50ml. Ces cellules sont reprises au 1/8ème dans le tampon de lyse et soniquées. La première étape de purification est une chromatographie d’affinité sur colonne de Nickel. Le gel SDS-PAGE (Figure 33a) indique qu’une protéine vers 100kDa est bien sur-exprimée. Un western blot réalisé avec des anticorps dirigé contre l’étiquette 10His nous montre que cette protéine est bien Artemis. Les fractions éluées en dernier sont très enrichies en Artemis. Les fractions sont regroupées en fonction du gel SDS- PAGE puis dialysées contre un tampon contenant 100mM KCl et chargées sur une colonne échangeuses d’anions Resource Q à pH8 (Artemis a un pI de 6). On obtient un pic principal lors du gradient en sels avec une conductimétrie de 14 mS/cm (donnée non montrée). Le gel SDS-PAGE montre que la protéine ainsi purifiée présente un degré de pureté satisfaisant. Nous obtenons à l’issu de la première étape, un lot de 3,2mg d’Artemis pour 200 ml de cultures (soir un rendement à cette étape d’environ 16mg d’Artemis par litre de culture). Une fraction seulement a été passée lors de cette purification sur ResourceQ ne permettant pas de définir à ce stade un rendement global de cette purification. L’essai réalisé sur une fraction suggère cependant que le rendement de l’étape de Resource Q est bon et que cette étape pourra être appliquée à l’avenir à l’ensemble du lot issu de colonne de Nickel. Les premières tentatives de concentration d’Artemis ont révélé une solubilité faible de l’enzyme. Les travaux à venir au laboratoire viseront à améliorer cette solubilité en ajoutant des protéines partenaires d’Artemis ou de l’ADN.

109 Figure 33a Purification d’Artemis.

(Gauche) Gel SDS-PAGE de l’étape de chromatographie par affinité sur colonne de Nickel, * protéine Artemis. Une dizaine de fractions de 25 à 34, présentes sur un second gel montre des fractions très enrichies en Artemis, comme la fraction 24 (données non montrées) (Droite) Gel SDS-PAGE de l’étape d’échangeuse d’anions Resource Q

Les travaux décrits dans la littérature ces dernières années sur Artemis et les essais de productions réalisés précédemment au laboratoire ont souligné les difficultés liées à la production de mg ou même de centaines de µg d’Artemis purifiée. La protéine a été purifiée à l’échelle de quelques µg pour des essais enzymatiques en exprimant la protéine en cellules 293T (Ma, 2002). Artemis n’a pas été cristallisée (hormi un peptide de 11 acides aminés, région 485-495, en complexe avec le domaine NTase de la Ligase4)(Ochi, 2013). On ne trouve également aucune étude biochimique ou biophysique nécessitant quelques mg de l’enzyme. Des études de production ont été commandées par JP de Villartay auprès de Protein Expert (devenue PX’Therapeutics (Grenoble), http://www.px-therapeutics.com). Cette compagnie effectue entre autre, la production de protéines recombinantes à demande dans E. coli ou en cellules d’insectes. Le rapport établi par cette compagnie indique que les essais de production dans E.coli avec ou sans chaperons co-exprimés ne permettent pas d’obtenir de façon satisfaisante de la protéine purifiée. Les essais de production par Protein Expert d’Artemis exprimée en corps d’inclusion et renaturée sont également négatifs. Enfin, les essais par cette compagnie de production en cellules d’insectes permettent de purifier avec un degré de pureté très moyen environ 100µg d’Artemis.

Des essais ont également été réalisés au CEA de Saclay en collaboration avec le laboratoire de M Gondry en exprimant Artemis dans E. coli en fusion avec 7 partenaires de fusion différents dont la GST, MBP, Trx et NusA. Les résultats les plus encourageants sont obtenus avec la MBP qui permet d’exprimer et de purifier quelques mg de MBP-Artemis. Cette fusion s’avère insoluble et l’étiquette MBP ne peut être retirée. Dans ce contexte, les

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résultats obtenus sur Artemis en cellules d’insecte au laboratoire sont extrêmement encourageants et seront poursuivis.

2.5 Co-purifications

2.5.1 Co-purifications de Ligase4-XRCC4 et Cernunnos

En parallèle, des purifications du complexe Ligase-XRCC4 et de Cernunnos séparément, nous avons réalisé des co-purifications en partant de 2 culots de 50ml de cultures de cellules d’insecte infectées par du virus de Ligase4-XRCC4 (1 culot) ou par du virus Cernunnos (1 culot). Les culots sont re-suspendus séparément puis lysés ensemble. La première étape est une colonne de Nickel pour fixer le complexe Ligase4-XRCC4 par l’étiquette 10His en Cter de XRCC4. La résine est lavée avec le tampon LA (100mM KCl, 50mM NaCl, 50mM imidazole). Le gel SDS-PAGE montre que dans la fraction du surnageant, les 3 protéines sont fortement sur-exprimées (Figure 33b Haut). Lors de la chromatographie sur la colonne de Nickel, Cernunnos est retenu par le complexe Ligase4-XRCC4. Une certaine fraction de Cernunnos est décrochée dans les lavages à 100mM KCl/50mM NaCl. Cette fraction peut correspondre à un excès de Cernunnos mais également à l’affinité moyenne mesurée entre Cernunnos et XRCC4 (Kd=4.1µM pour les formes tronquées XRCC4(1-157)- Cernunnos(1-224)) (Ropars, 2011). A cette étape, nous obtenons 1,9mg du complexe pour 100ml de culture de cellules d’insectes.

2.5.2 Co-purification de Ligase4-XRCC4 et Ku70/Ku80

En parallèle, des purifications du complexe Ligase-XRCC4 et Ku70/Ku80 séparément, nous avons réalisé des co-purifications en partant de 2 culots de 50ml de cultures de cellules d’insecte infectées par du virus de Ligase4-XRCC4 (1 culot) ou par du virus Ku70/Ku80 sans étiquette (1 culot). Le protocole suivi est semblable à celui décrit ci-dessus pour la co- purification de L4-X4 et Cernunnos. Les culots sont re-suspendus séparément puis lysés ensemble. La première étape est une colonne de Nickel pour fixer le complexe Ligase4- XRCC4 par l’étiquette 10His en Cter de XRCC4. Le gel SDS-PAGE de cette étape montre que Ku70/Ku80 est retenu par le complexe Ligase4-XRCC4 (Figure 33b Bas). Lors du lavage, une certaine fraction de Ku70/Ku80 est décrochée. Cette fraction peut correspondre à un excès de Ku70/Ku80. On peut noter que la co-purification nous permet de purifier du complexe

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Ku70/Ku80 dans la fraction non-retenue de cette étape alors que les essais de purification de Ku70/Ku80 sans étiquette à partir de culots de Ku70/Ku80 ne nous ont pas permis de purifier le complexe. A cette étape, nous obtenons 1,9mg du complexe L4-X4-Ku70-Ku80 pour 100ml de culots.

Figure 33b Co-purifications de Ligase4-XRCC4 et Cernunnos et de Ligase4-XRCC4 et Ku70/Ku80

(Haut) Co-purification de Ligase4-XRCC4(10his) et Cernunnos à partir d’un culot de 50ml de cultures d’insectes chacun. Protocole (gauche) et gel SDS-PAGE (droite). (Bas) Co-purification de Ligase4- XRCC4(10his) et Ku70/Ku80 à partir d’un culot de 50ml de culture de cellules d’insectes pour chacun. Protocole (gauche) et gel SDS-PAGE (droite).

2.6 Les améliorations apportées au laboratoire au système de production en