2. Expression en cellules d’insecte des protéines de la voie NHEJ
2.2 Clonages
2.2.1 Clonage des séquences de XRCC4 et de la Ligase4 dans pKL.
La séquence codante pour la protéine humaine entière Ligase4 (aa 1-911) (gène fourni par JP de Villartay, Institut Imagine, Paris) a été clonée dans le vecteur pKL dans le site MCS1 en utilisant les sites de restrictions BamHI et XbaI. Après transformation de cellules d'E. coli XL1Blue par choc thermique, puis sélection des colonies obtenues sur LB supplémenté de kanamycine et de gentamycine, le succès du clonage a été vérifié par PCR sur colonies. Le vecteur pKL-LigIV a ensuite été amplifié et purifié par miniprep pour insérer la séquence codante de la protéine humaine entière XRCC4 (X-ray repair cross- complementing 4) (aa 1-336) sur le site MCS2 en utilisant les sites de restrictions XhoI et SphI à partir de l'amplification d'un gène présent sur un plasmide fourni par l'équipe de JP de Villartay. La séquence codante pour une étiquette 10 histidines a été ajoutée en C-ter de XRCC4, sans site de clivage entre l’étiquette et la protéine. Aucune étiquette n’a été ajoutée à la séquence de la Ligase4. Après transformation par choc thermique et vérification de la présence des séquences codantes pour la Ligase4 et pour XRCC4 dans les clones par PCR sur colonies, le vecteur pKL-XRCC4-LigIV est amplifié et purifié par miniprep (Figure 23).
72
Figure 23 : Cartes des différents plasmides utilisés dans cette étude.
Les séquences codant pour les protéines sont en bleu (sauf pour Artemis où les 3 domaines sont coloriés). Les résistances sont représentées en vert. Le plasmide construit pour DNA-PKcs est présenté mais n’a pas été utilisé dans la thèse. Il est utilisé actuellement au laboratoire pour essayer de produire la kinase.
73
2.2.2 Clonage des séquences de Cernunnos dans pFL
La séquence codant pour la protéine humaine entière (aa 1 à 299) a été amplifiée par PCR à partir d'un plasmide donné par JP de Villartay et clonée dans le vecteur pFL en utilisant les sites XbaI et XhoI (Figure 23).
2.2.3 Clonage des séquences de Ku70/80 avec ou sans étiquette dans pUCDM et pFL. Les séquences sauvages de Ku70 et Ku80 humain sont amplifiées à partir de plasmides fournis par l'équipe de Patrick Calsou (IPBS, Toulouse) puis clonées dans le vecteur pUCDM en utilisant respectivement les enzymes XmaI/NheI et BssHI/SalI. Le vecteur pUCKu70/80 obtenu est séquencé pour vérifier l'intégrité des séquences. Le vecteur pUCDM étant un vecteur donneur, les séquences de Ku70 et Ku80 pourront être aisément transférées dans des vecteurs accepteurs comportant déjà d'autres protéines du NHEJ par la suite. En revanche, la production du complexe Ku70/80 ne peut être faite directement à partir de ce vecteur, c'est pourquoi nous avons réalisé une fusion de plasmide grâce la recombinase CreLox, en utilisant les vecteur pUCKu70/80 et pKDummy. Le vecteur pKDummy est une version simplifiée du vecteur pKL ne comportant par de sites de clonage mais un site loxP et les sites de recombinaison Tn7L et Tn7R. Le vecteur obtenu a été nommé pKdum_Ku70/80 (Figure 23).
Une autre version d’un vecteur codant pour le complexe Ku70/80 est obtenue à partir de gènes synthétiques. Ces gènes, commandés chez Genscript.Cette compagnie a développé un algorithme, OptimumGene qui permet d’optimiser une séquence nucléotidique sur différents paramètres en vue d’améliorer l’expression dans un hôte donné. Les paramètres optimisés à travers des mutations silencieuses dans le gène sont l’adaptation aux codons les plus fréquents dans l’hôte utilisé et surtout la réduction des structures secondaires susceptibles d’être formées par les mRNA
(http://www.genscript.com/codon_opt.html). Dans cette version, le gène codant pour Ku80
est précédé d'une séquence de 10 Histidines suivie d'un site de coupure par la protéase TEV, que nous produisons au laboratoire. Les séquences de Ku70 et Ku80 ont été clonées dans le vecteur pFL par l'utilisation des enzymes XhoI/NheI et BamHI/HindIII respectivement conduisant à l'obtention du vecteur pFL Ku70_80_opt (Figure 23).
74
2.2.4 Clonage de la séquence d’Artemis dans pFL.
Un gène synthétique, codant pour la protéine Artemis, a été commandé chez Genscript, les données de la littérature suggérant une faible expression d’Artemis en cellules d’insecte. Le gène synthétique est construit par Genscript à partir de la séquence nucléotidique d’Artemis, déterminée par JP de Villartay lors de la découverte de la protéine
(Moshous, 2001). Comme pour Ku70 et Ku80, cette séquence est optimisée en vue de la production en cellules d'insecte. Une séquence additionnelle de 10 Histidine est ajoutée à l'extrémité C-terminale de la protéine, sans site de coupure entre l’étiquette et la protéine. Artemis a été clonée dans le vecteur pFL grâce à l'utilisation des enzymes BamHI et XbaI.
Deux versions plus courtes de la protéine ont été obtenues par insertion d'une cassette comportant une séquence codant pour 10His suivi d'un codon stop après les positions 370 et 500. Dans chaque cas, une mutation silencieuse a été faite afin de révéler un site de coupure unique dans la région où la cassette devait être introduite. Les versions 1- 370 et 1-500 d’Artemis correspondent à deux versions de la protéine contenant les domaines β-lact/βCasp mais des régions C-terminales de tailles réduites, cette région ayant été prédite comme étant peu structurée (Callebaut, 2002).
2.2.5 Clonage des séquences de DNA-PKcs dans pACBAC2.
Un gène synthétique codant pour la séquence de DNA-PKcs a été commandé chez Genscript par notre collaborateur I Berger dans le cadre d’un projet ANR. Les données de la littérature suggèrent comme pour Artemis des niveaux d’expression très faible de DNA-PKcs par voie recombinante. Le gène synthétique est construit par Genscript à partir de la séquence nucléotidique de DNA-PKcs, clonée pour la première fois par le laboratoire de S Jackson (Hartley, 1995). Le gène synthétique est introduit dans le vecteur pACBAC2. Une séquence aditionnelle de 10His suivie d'un site de coupure par la protéase TEV a été ajoutée en position N-terminale (Figure 23).