Préparation des Virus

Le vecteur donneur contenant les séquences des protéines à produire est utilisé pour transformer des cellules EMBacY par électroporation. Ces bactéries transformées sont étalées sur LB supplémenté de X-gal 40µg/mL, d'IPTG 0,1mM, de kanamycine 30µg/ml, de tetracycline 20µg/ml, de gentamycine 20µg/ml. L'insertion du vecteur dans le bacmide se fait par recombinaison in vivo via les sites Tn7 et grâce à la présence de T7 recombinase codée par un plasmide présent dans les cellules. Les sites Tn7 portés par le bacmide se trouvent à l'intérieur de la séquence codant pour le fragment lacZ (Figure 24). Lorsque les séquences de protéines recombinantes sont insérées dans le bacmide, le fragment lacZ est interrompu et ne peut plus complémenter la ß-galactosidase déficiente produite par la bactérie. La bactérie ne peut plus métaboliser le X-gal et libérer le produit de couleur bleue. Les colonies blanches, ayant inséré le plasmide, sont isolées et striées sur LB supplémenté de la même façon.

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Figure 24 : Schéma du protocole de production des vecteurs d’expression en système Multibac.

(Haut) Description des étapes principales de la production en cellules d’insecte. (Bas) Aspect morphologique de cellules infectées et non-infectées par un baculovirus (issus du Web)

Ces clones sont mis en culture (2mL) en LB supplémenté en antibiotiques (Kan 30 µg/ml, Tet 20 µg/ml, Gent 20 µg/ml) une nuit à 37°C afin d'obtenir une préparation de bacmide (cf Annexe 1). Ce bacmide est être utilisé pour transfecter 1x106 cellules Sf21 dans du milieu de culture SF900 II, disposées dans une boîte de culture 6 puits. Il est primordial d’effectuer la purification du bacmide juste avant de réaliser la transfection. Ce paramètre est déterminant dans le succès de la transfection. Les cellules ne sont pas adhérentes, et

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doivent être déposées la veille ou quelques heures avant la transfection de façon à ce qu’elles se déposent au fond des boîtes 6 puits. Un taux de confluence compris entre 70% et 90% de confluence est recommandé.

Les boîtes sont inspectées chaque jour pour vérifier l'absence de contamination (Figure 24). Au bout de 3 jours, le surnageant de culture des puits manifestant des signes d’infection est collecté et conservé à 4°C à l’abri de la lumière, il s'agit du stock V0 de virus. 3mL de milieu de culture neuf sont ajoutés afin de permettre aux cellules de proliférer 3 jours supplémentaires. Les cellules sont ensuite collectées en raclant le fond des plaques 6 puits.

Les cellules d’insecte récoltées lors cette première étape servent à réaliser un premier test d’expression lors de la production d’une nouvelle protéine ou d’un nouveau complexe. On peut ainsi vérifier à l’aide d’un western blot la présence de la protéine d’intérêt. La concentration finale des cellules est calculée en comptant les cellules par microscopie optique à l'aide d'une cellule de Malassez ou dans un compteur de cellule BioRad TC10. Environ 1x106 cellules sont centrifugées à 3000G, à 4°C pendant 5 minutes, le surnageant est retiré et les cellules sont re-suspendues dans 1mL PBS 1X. Les cellules sont lysées par sonication. 10µL du lysat sont prélevés et conservés à 4°C et constituent un échantillon de la fraction totale des protéines. Le reste du lysat est centrifugé à 20000G à 4°C pendant 15 minutes. 10µL de surnageant sont prélevés et conservés à 4°C, il s'agit de la fraction soluble des protéines. Les fractions totales et solubles prélevées sont déposées sur gel SDS-PAGE. Le reste de la fraction soluble du lysat est analysée par fluorimétrie pour détecter la présence ou non de YFP en utilisant comme longueur d’onde d’excitation 488nm et 520nm comme longueur d’onde d’émission.

Le volume de surnageant V0 étant relativement faible, il est nécessaire de l’amplifier une fois, en infectant un volume plus important de culture cellulaire, pour collecter la seconde génération de virus, appelée V1. La totalité du V0 (3 ml) est utilisé pour infecter 25 ml de cellules à 0,5x106 cellules/ml. Les cellules sont comptées toutes les 24h et le volume est ajusté afin de conserver une concentration de 1x106 cellules/ml tant que les cellules continuent de doubler. Lorsque les cellules croissent sans doubler, on a atteint le jour appelé DPA (Day after Proliferation Arrest) et le prélèvement du surnageant de culture se fait le

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lendemain (dpa+24) par centrifugation et constitue le stock V1. Cette génération de virus servira pour toutes les infections et productions suivantes.

2.5. Titration des virus

La titration des particules virales est effectuée par la méthode de dilution limite en plaque 96 puits. Une culture de Sf21 à 2*106 cellules/ml en phase exponentielle est diluée à 0,5*106 cellules/ml puis distribuée à raison de 100µL par puits. Après 1h d'incubation à 27°C le surnageant est éliminé et remplacé par 100µL de milieu frais, 100µL de solution virales est alors ajoutée. Une dilution en cascade de 2 en 2 est alors réalisée à partir du puits initial. 3 puits par dilution sont ainsi effectués. On laisse incuber pendant 6 jours à 27°C sans agitation. La lecture se fait au microscope à fluorescence. Chaque puits est noté positivement ou négativement en fonction de la présence ou non de cellules produisant de la YFP. On groupe alors les scores par 3 dilutions successives (ex: 321 signifie 3 tubes (+) dans la première dilution, 2 dans la suivante et 1 dans la troisième). On prend en compte la suite de dilutions donnant le score le plus élevé mais inférieur à 330. On consulte alors la table de Mc Grady (Annexe 3) qui donne le nombre le plus probable de particules dans la première dilution en fonction du score.