8.1. Principe
C’est une technique de marquage immunocytochimique permettant de visualiser in situ des complexes formés de deux protéines localisée à une distance inférieure à 40 nm.
Deux anticorps primaires produits à partir d’espèces différentes sont chacun dirigés contre une protéine spécifique du complexe à étudier (Figure 24, a). Ces derniers sont incubés en présence d’anticorps secondaires conjugués à des oligonucléotides (Figure 24, b). Chaque anticorps secondaire est dirigé contre l’isotype d’un des deux anticorps primaire utilisé. Lorsque la distance entre les deux protéines d’intérêt est ≤ 40 nm, une ligase associe les nucléotides complémentaires entre eux (Figure 24, c), puis une polymérase utilise des nucléotides pour assurer l’élongation et l’amplification de la boucle d’ADN de façon circulaire (Figure 24, d). Par la suite, l’association à des oligonucleotides fluorescents (Figure 24, e) permet l’observation des interactions protéiques au microscope fluorescent.
Figure 24 : Etape de la technique de PLA (M A BobriCh and Shwab, 2013).
8.2. Protocole
Dans un premier temps, les artères coronaires fraichement isolées sont digérées enzymatiquement afin d’isoler les CMLVs. Ces dernières sont ensuite fixées puis perméabilisées et enfin incubées avec les anticorps primaires. A la suite de ceci le protocole proprement dit de PLA peut commencer.
8.2.1. Isolement des CMLVs
Elle est réalisée de la même manière que pour la technique de patch-clamp, partie 4.4 des matériels et méthodes. La différence réside dans le processus de digestion utilisé. En effet, l’ACG est infusé dans la papaine à 1,5 mg/ml pendant 1 h, après quoi du DDT est ajouté (1 mg/mL). Le tissu est alors incubé à 37°C pendant 6 min sous légère agitation. Il est ensuite
a b c d e
protéine cible anticorps primaire
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transféré dans une solution de dissociation (MD, décrite plus haut, Cf section IV.D. contenant un mélange de la collagénase H (Roche, 1074032 ou Sigma Aldrich, C7926) (1,6 mg/mL) et d’inhibiteur de la trypsine (Sigma Aldrich, T6522) (1,6 mg/mL) puis incubée à 37°C pendant 4 min. La suite du processus d’effectue comme décrit précédemment – rinçage, centrifugation légère et resuspension dans du milieu MD.
8.2.2. Fixation des CMLVs
Une goutte de suspension cellulaire (50 mL si CMLVs de rat jeune et 100 µL si CMLVs de rat SHAM/IC) est déposé sur une lamelle de 12 mm de diamètre et laisser adhérer au moins 20 min puis fixer avec du PFA 4% (préparée dans du PBS) pendant 10 min à température ambiante.
8.2.3. Perméabilisation et quenching
Après 3 lavages de 5 min au PBS, les CMLVs sont perméabilisées avec une solution contenant 0,1% Triton X-100 et 0,2% BSA pendant 10 min à température ambiante puis directement incubées dans une solution de quenching à 50 mmol/L de NH4Cl (préparée dans du PBS) pendant 30 min à température ambiante. Cette dernière étape permet de limiter l’autofluorescence. A la suite, les lamelles sont lavées pendant 5 min avec une solution de PBS et le protocole de PLA (Duolink® PLA, Sigma-Aldrich) proprement dit est effectué suivant les recommandations du fournisseur.
8.2.4. Protocole de PLA
Toutes les incubations ont lieu en chambre humide. Les tampons A et B utilisés pour les lavages sont préparés par nos soins selon les indications du fournisseur dans de l’eau ultra pure. Le tampon A contient (en mol/L : 0,01 Tris, 0,15 NaCl, 0,05% Tween-20 et le pH est ajusté à 7,4) le tampon B contient (en mmol/L) : 0,2 Tris, 0,1 NaCl le pH est ajusté à 7,5. Les solutions de blocage, de ligation et polymérisation sont vendues avec le coffret (Duolink® PLA, Sigma-Aldrich). Toutes les expériences de PLA ont été réalisées le même jour afin de limiter la variabilité du signal obtenu finalement.
- Incubation des lamelles avec la solution de blocage 1h à 37°c.
- Incubation avec les couples d’anticorps primaires toute la nuit à +4°C : chaque couple contient l’anticorps dirigé contre la α-BKCa (1/300, espèce animale : souris). Ce dernier est associé soit à un anticorps anti-PDE4 « pan-specifique » (1/100; #PD4-101AP, FabGennix, Frisco, TX, USA, espèce animale : lapin), soit aux anticorps anti-PDE3A (1/300, espèces animale : lapin), ou anti-PDE4B (1/100, espèce animale : lapin) décrits plus haut.
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- Après deux lavages de 5 min chacun avec le tampon A, les lamelles sont incubées pendant 1h à 37°C avec un mélange d’anticorps secondaires conjugués anti-souris et anti-lapin dilués au 1/5ème dans un tampon spécial présent dans le coffret.
- Après deux lavages de 5 min chacun avec le tampon A, les lamelles sont incubées avec la solution de ligation pendant 30 min à 37°C. Elle est préparée par dilution de la solution stock au 1/5ème dans de l’eau ultrapure. La ligase diluée au 1/40ème, très fragile, est ajoutée extemporanément, juste avant le dépôt sur les lamelles.
- Après deux lavages au tampon A, c’est l’étape d’amplification. Il s’agit d’une étape cruciale où il y a ajout des nucléotides, oligonucléotides fluorescents et des cofacteurs de la polymérase. Elle doit être réalisée à l’abri de la lumière. La solution de polymérisation se prépare de la même façon que la solution de ligation et la polymérase diluée au 1/80ème doit être ajoutée extemporanément, juste avant dépôt sur les lamelles. Elles sont incubées à 37°C pendant 100 min. Des expériences préliminaires réalisées sur des CMLs de rat SHAM et IC nous ont révélés une saturation du signal fluorescent pour le couple BKCa-PDE4B. Afin de pouvoir quantifier ce signal, nous avons décidé de réduire le temps d’amplification à 90 min.
- Enfin, les lamelles sont lavées deux fois avec le tampon B pendant 10 min puis 1min avec le tampon B dilué au 1/100ème dans de l’eau ultra pure.
- Montage des lamelles avec une préparation de mowiol (Mowiol® 4,88 g, glycerol 6 g, TrisHCl 0,2 mol/L, l’ensemble des produits sont commercialisés par Sigma Aldrich). Les lames sont laissée à sécher dans une boite à l’abri de la lumière et a +4°C.
8.2.5. Observation des lames
Elle se fait dans un microscope à fluorescence (SP5, Leica Microsystèmes SAS) à l’aide d’un objectif à eau, à grossissement x60. Le signal PLA est détecté par excitation avec un laser à 554 nm et une émission à 579 nm. Des paramètres d’acquisition identiques ont été utilisés pour l’observation de la fluorescence émise par chaque couple d’anticorps.
8.3. Analyse des images
Les images Tiff ont été récupérées pour être analysées à l’aide d’ImageJ. Chaque image a été transformé en 8 bits puis binarisée en utilisant une valeur seuil, fixée arbitrairement et spécifique de chaque couple d’anticorps. Cette valeur a été déterminée de manière à pouvoir visualiser les points fluorescents de façon claire et distincte du signal de fond. Les résultats sont exprimés en % de la surface cellulaire couverte par le signal fluorescent. Pour chaque analyse, les résultats sont exprimés selon la moyenne ± SEM. Le nombre de données pour chacun des groupes est désigné par n, correspondant à une cellule.
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