Les effecteurs vasculaires de l’AMPc

Classiquement, les effets de l’AMPc sont attribués à la PKA. Cependant il a été décrit l’implication de la PKG dans des conditions en faveur d’une forte augmentation de la [AMPc]. De plus, les études récentes ont permis de mettre en évidence l’existence d’un nouvel effecteur, Epac.

2.1.2.1. La protéine kinase A

La PKA est un hétérotétramère formé de deux sous-unités régulatrices (R) et deux sous-unités catalytiques (C) (Taylor et al., 1990). La unité R permet de limiter l’activation de la sous-unité C tant qu’elle reste liée à elle. Chaque sous-sous-unité régulatrice porte deux sites de fixation pour l’AMPc : le site A et le site B. seule l’occupation de chacun des 4 sites par une molécule d’AMPc active la PKA et permet la dissociation des sous-unités C et R. La conformation spatiale de la PKA à l’état inactif ne permet que la fixation de l’AMPc sur les sites B. A la suite,

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il se produit un changement de conformation qui dévoile les sites A. La sous-unité C se dissocie de la sous-unité R et va réguler l’activité de plusieurs protéines cibles par phosphorylation.

Lorsque le taux d'AMPc diminue, les sous-unités R libèrent l’AMPc et se réassocient avec les sous-unités C, les inhibant à nouveau (Taskén and Aandahl, 2004).

L’utilisation de colonne chromatographique échangeuse d’ions a permis de séparer la PKA en deux types : la PKA de type I et la PKA de type II. Chacune possède sa propre sous-unité R (RI et RII) (Corbin and Keely 1977). Par la suite, l’utilisation des techniques de biologie moléculaire a permis de classer la unité R en types : RIα, RIβ, RIIα et RIIβ et la sous-unité C en 4 sous-type Cα, Cβ, Cγ et PRKX ou human X chromosome-encoded protein kinase

X (Taskén and Aandahl, 2004). Les 2 classes de PKA présentent des affinités différentes pour

l’AMPc avec une constante d’activation de 50-100 nM pour les PKAI et 200-400 nM pour les PKAII. Les sous-unités R présentent des profils d’expression cellulaire et tissulaire différents et sont capables de s’homo- ou s’hétéro-dimériser générant ainsi un large panel de combinaisons responsables de la diversité et de la spécificité des réponses dépendantes de l’AMPc. Outre la régulation de la sous-unité catalytique de la PKA par ses sous-unités R, un peptide nucléaire, le PKI (protein kinase inhibitor), se lie à la sous-unité C et inhibe son activité indépendament de l’AMPc (Kopperud et al., 2003). Le PKI est retrouvé dans le noyau et agit également en protéine chaperonne assurant l’export de la sous-unité C du noyau vers le cytoplasme. Les sous-unités C de retour dans le cytoplasme vont alors former des tétramères de PKA inactifs (Fantozzi et al., 1994).

La localisation subcellulaire de la PKA jouerait un rôle prépondérant dans le contrôle et la spécificité des effets induits par l'activation de la kinase. En effet, si la limitation de diffusion de l'AMPc dans le cytoplasme permet une compartimentation des signaux cellulaires liés à l’AMPc, celle-ci implique une localisation de la PKA au plus près des protéines cibles effectrices à activer spécifiquement. Ainsi, lorsque la concentration en AMPc augmente au voisinage d’une protéine d’ancrage de PKA (AKAP : A-Kinase Anchoring Protein), sa liaison à la sous-unité R libère la sous-unité C de la PKA qui peut ainsi phosphoryler rapidement et localement le substrat effecteur lié à l’AKAP. Ces protéines d’ancrage assurent donc une grande spécificité et une régulation spatio-temporelle des réponses cellulaires (Scott and Santana, 2010).

Au niveau vasculaire, il est admis que la PKA participe aux effets vasorelaxants des agents stimulant la production d’AMPc tel que les récepteurs β-adrénergiques ou l’adénosine. En effet deux études du groupe de Silver et al. (1982, 1984) (Silver et al., 1982, 1984), réalisées à partir

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d’artère coronaire bovine, ont permis de corréler l’effet relaxant de l’isoprénaline et de l’adénosine à l’augmentation de l’activité enzymatique de la PKA. De plus, l’étude de Eckly et des collaborateurs (Eckly-Michel et al., 1997) a démontré par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la PKA, le H89, que l’effet vasorelaxant de faibles concentrations d’isoprénaline était dépendant de la PKA. Si la stimulation non sélective des récepteurs β1 et β2 semble impliquer exclusivement la PKA, une stimulation spécifique des récepteurs β2 ne semble impliquer la PKA qu’en partie. C’est ce qu’a révélé l’étude de Ferro (Ferro et al., 2004) sur de l’aorte de rat, dans laquelle la relaxation fait intervenir la voie PI3K/Akt en plus de celle de la PKA. De plus, il a été proposé que les faibles concentrations d’AMPc activent préférentiellement la PKA tandis que des concentrations plus élevées activent en plus la PKG (Murthy and Makhlouf, 1995). L’implication de la PKG permettrait la mise en jeu d’effecteurs de la voie de signalisation du GMPc.

2.1.2.2. Le facteur d’échange Epac

En 1998, une nouvelle famille de protéines activées par l’AMPc, nommé Epac pour exchange

protein directly activated by cAMP a été découverte (Kawasaki et al., 1988; de Rooij et al.,

1998). L’AMPc se lie à la protéine Epac pour activer la famille Ras des petites GTPases, Rap1 et Rap2 (Bos, 2006), ce qui entraîne l’échange du GDP en GTP sur ces petites protéines G, permettant ainsi leur interaction avec les effecteurs spécifiques. L’activation de ces effecteurs contribue aux effets de l’AMPc qui sont donc indépendant de la PKA.

Epac est une protéine qui porte en sa région N-terminale des sous-unités régulatrices et une sa région C-terminale, des sous-unités catalytiques.

La région N-terminale se compose :

- D’un domaine d’adressage intracellulaire nommé DEP pour Dishevelled, Egl-10,

Pleckstrin.

- D’un domaine de liaison à l’AMPc nommé CNB pour Cyclic nucleotide-binding domain dont la séquence est très proche de celle de la sous-unité R de la PKA.

La région C-terminale se compose :

- D’un domaine REM pour Ras exchange motif stabilisant le domaine d’échange du GDP en créant un pont intramoléculaire entre les régions régulatrice et catalytique.

- D’un domaine GEF responsable de l’activité d’échange du GDP en GTP sur les petites protéines G.

La protéine Epac existe sous deux isoformes, Epac1 et Epac2, produits de deux gènes indépendants chez les mammifères mais présentant une grande homologie de structure.

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Epac1 est décrit pour être exprimé dans la CMLV (Purves et al., 2009; Roberts et al., 2013a) tandis que l’expression d’Epac2 est limitée au muscle lisse bronchique (Roscioni et al., 2011). Au niveau de l’endothélium, seule l’isoforme Epac1 a été détectée dans les HUVEC (Human

umbilical vein endothelial cells) (Kooistra et al. 2005) et il a été montré que celle-ci possédait

un effet anti-inflammatoire au niveau des cellules endothéliales en inhibant la sécrétion de l’interleukine-6 pro-inflammatoire, mais également en limitant la migration leucocytaire (Parnell et al., 2012).

Le rôle d’Epac dans le contrôle du tonus vasculaire a été peu étudié. Néanmoins, il a été suggéré qu’Epac régule l’activité de certains canaux potassiques importants pour l’établissement du potentiel de membrane. On distingue d’abord l’équipe de Purves qui a montré que dans les CMLs d’aorte de rat, Epac1 intéragissait physiquement avec la sous-unité SUR2B (Sulfonylurea receptor 2B) des canaux KATP et que l’activation d’Epac1 semblait inhiber l’activité de ces canaux potassiques (Purves et al., 2009). Plus récemment, il a été montré que l’activation de la protéine Epac intéragissait avec le couplage RyR- BKca dans les artères mésentériques de rat. En effet, l’application d’un activateur d’Epac augmente la fréquence des

sparks calciques dans les CMLVs. Cette augmentation localisée de la concentration de Ca²⁺

cytosolique active alors les BKca, responsables d’une hyperpolarisation de ces cellules et de la vasorelaxation (Roberts et al., 2013a).