Projet II : rôle des PDEs-AMPc dans la régulation du tonus vasculaire au
2. Résultats
2.1. Mesure de l’activité PDE-AMPc dans les artères mésentériques de rats SHAM et
mésentériques de rats SHAM et IC
Le dosage de l’hydrolyse de l’AMPc par les PDEs a été réalisé à partie des artères mésentériques de rats SHAM et IC par dosage radioenzymatique, dans les mêmes conditions utilisées que lors de l’étude de l’aorte (Hubert et al., 2014).
Dans ce tissu, l’activité totale PDE-AMPc dans les artères mésentériques semble être diminuée de moitié chez les rats IC par rapport aux rats SHAM (Figure 1R). La contribution des familles de PDE 1, PDE2, PDE3 et PDE4 a été évaluée par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs. Dans les artères mésentériques de rats SHAM, l’activité PDE1, MIMX (10 μM) est faible et ne représente que 7% de l’activité PDE-AMPc totale, alors qu’aucune activité sensible au BAY-60-7550 (BAY, 100 nM), un inhibiteur sélectif de la PDE2 n’a été détectée. Les inhibiteurs
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sélectifs de la PDE3 et de la PDE4, respectivement le cilostamide (Cil, 1 μM) et le Ro-20-1724 (Ro, 10 μM) ont révélé des activités respectivement à 56% et 21% de l’activité totale. En résumé, l'ordre de classement des familles de PDE contribuant à l’activité globale d’hydrolyse de l’AMPc dans les artères mésentériques de rats SHAM est : PDE3 > PDE4 >PDE1. Dans les artères mésentériques isolées de rats IC, les activités PDE1, PDE3 et PDE4 représentent, respectivement, 18%, 48% et 37% de l’activité PDE-AMPc totale, alors que l’activité PDE2 n’a pas été détectée. Ainsi, le profil d’activité PDE-AMPc dans l’artère mésentérique des rats IC est le suivant : PDE3 ≈ PDE4 > PDE1. Comparativement aux artères isolées de rats SHAM, il semblerait que l’activité PDE3 soit réduite de moitié chez les rats IC, mais cette diminution est non significative.
J’ai par la suite entrepris des dosages en optimisant les conditions du dosage afin d’améliorer la détection de la PDE2. Notamment, la PDE2 étant activée par le GMPc, certains dosages ont été réalisés en présence de 5 µM de GMPc. De plus, l’affinité de la PDE2 pour l’AMPc étant faible (Km 30-50 µM), des expériences ont été conduites en utilisant plusieurs concentrations d’AMPc (10 µM et 100 µM), au lieu de 1 µM utilisé pour le protocole standard. Afin d’augmenter la sensibilité du dosage, une quantité plus importante (70 µg) d’extrait protéique a été utilisée dans certains essais. Ces essais de mise au point n’ont cependant pas permis de mettre en évidence une activité significative sensible au Bay 60-7550 ou stimulée par le GMPc.
Figure 1R : Dosage de l’hydrolyse de l’AMPc par les PDEs dans les artères mésentériques isolées de rats SHAM et IC. L'activité PDE-AMPc a été mesurée en présence de 1 μM de [3 H]-AMPc. Le profil d’activité des PDE-AMPc a été déterminé en absence (activité totale) ou en présence de l’inhibiteur non sélectif des PDE, IBMX (1 mM) ou d’un inhibiteur sélectif d’une
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famille de PDE (PDE1 : MIMX, 10 μM; PDE2 : BAY 100 nM; PDE3 : Cil, 1 μM; PDE4 : Ro, 10 μM). Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM de 3 expériences indépendantes.
2.2. Effet de l’inhibition des PDEs sur la réponse contractile
des segments d’artères mésentériques de rats SHAM et IC
La contribution des principales familles de PDE3 et PDE4 dans le contrôle du tonus vasculaire de l’aorte de rat IC et SHAM a prélabalement été explorée par notre équipe (Hubert et al., 2014). Le rôle de la PDE2 a par la suite été éxploré par l’étude de la réponse contractile à une prostaglandine vasoconstrictrice, la PGF2α, sur des segments d’aorte de rat IC et SHAM préalablement incubés avec l’inhibiteur sélectif de PDE2 : BAY, 100 nM (Figure 2R ci dessous). Les résultats indiquent que le BAY ne modifie pas la réponse contractile à la PGF2α dans les deux groupes de rats IC et SHAM.
Par la suite, nous nous somme intéressés au rôle de ces familles de PDE dans le contrôle du tonus vasculaire de l’artère mésentérique chez les rats IC et SHAM, nous avons d’abord étudié la réponse contractile à l’U46619. Pour cela, les segments d’artères mésentériques ont été au préalable incubés en présence des inhibiteurs sélectifs de PDE2 : BAY, 100 nM, de PDE3 : Cil, 1 μM ou PDE4 (Ro, 10 μM) avant de réaliser une courbe concentration-effet à l’U46619. Chez les rats SHAM, seul le BAY et le Ro ont « retardé » le développement de la réponse contractile à l’U46619 ce qui se traduit par un décalage significatif de la courbe vers la droite (Figure 4R, A) par rapport au contrôle. Ce décalage est objectivé par la diminution significative des pD2 en présence de BAY et Ro (Figure 4R, B) en comparaison au contrôle. Seul le Ro a diminué significativement l’effet maximal (P < 0,05, données non représentées).
Chez les rats IC, la réponse contractile à l’U46619 est également significativement potentialisée en comparaison au rats SHAM (Figure 2, pD2 = 6,72 ± 0,07 chez les SHAM et pD2 = 7,05 ± 0,09 ; * : P < 0,05). De plus, il est retrouvé un effet significatif du BAY et du Ro sur la réponse contractile à l’U46619. De manière intéressante, un effet du Cil est cette fois observé (Figure 4R, C). L’ensemble de ces effets sont objectivés par une diminution significative des pD2 (Figure 4R, D) en présence de chacun des 3 inhibiteurs de PDE testés, alors que l’effet maximal des réponses n’a pas montré de différence significative.
Ces résultats révèlent donc, d’une part, une hyperréactivité des artères des rats IC à l’U46619 en comparant aux rats SHAM. D’autre part ils indiquent une implication des PDE2 et PDE4 dans la régulation d’une réponse à un agent contractant, l’U46619, tandis que le rôle de la PDE3 n’est révélé que dans l’IC.
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Figure 2R : Réponse contractile à des concentrations cumulatives de PGF2α dans les aortes isolées de rats SHAM et IC. Les courbes concentration-effet à la PGF2α (10-9 M à 3.10-5 M) ont été réalisées en présence de l'inhibiteur sélectif de PDE2 (BAY, 100 nM) ou du véhicule DMSO (Ctr). Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM de N = 5-7.
Figure 3R : Réponse contractile à des concentrations cumulatives d’U46619 dans les artères mésentériques isolées de rats SHAM et IC. Les courbes concentration-effet à
l’U46619 (10-9 M à 3.10-6 M) ont été réalisées sur des segments d’artères mésentériques isolées de rat SHAM et IC. Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM de N = 9-16, *** : P<0,001.
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Figure 4R : Effet de l’inhibition de la PDE2, PDE3 et PDE4 sur la réponse contractile induite par des concentrations cumulatives d’U46619 dans les artères mésentériques isolées de rats SHAM (A, B) et IC (C, D). Les courbes concentration-effet à l’U46619 (10-9
M à 3.10-6 M) ont été réalisées en présence de l'inhibiteur sélectif de PDE2 (BAY, 100 nM) ou de PDE3 (Cil, 1 μM) ou PDE4 (Ro, 10 μM) ou de leur véhicule DMSO (Ctr). Les contractions sont exprimées en pourcentage de l’amplitude de la réponse à la solution « K80 ». B et D représentent respectivement les pD2 des courbes en A et C. Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM de N = 9-16.* : P < 0,05; ** : P < 0,01; *** : P < 0,001 versus Ctr (ANOVA (2 voies pour mesure répétées pour A et C; 1 voie pour B et D).