Présentation synthétique des résultats supplémentaires

2.2.1. Caractérisation du profil d’activité d’hydrolyse de

l’AMPc dans l’artère artères coronaires de rat

Des études précédentes réalisées dans plusieurs lits vasculaires ont rapporté que les PDE3 et PDE4 étaient les deux principales familles hydrolysant l’AMPc (Hubert et al., 2014; revue par Polson and Strada, 1996). C’est pourquoi, nous avons vérifié cette hypothèse dans notre modèle d’étude, l’artère coronaire gauche de rat (ACG). L’activité totale mesurée est de 76 ± 11 pmol/min/mg (Figure supplémentaire 1 ci-dessous). La contribution des familles de PDE3 et PDE4 a été évaluée par l’utilisation d’inhibiteurs séléctifs. L’activité de la PDE3, mesurée en présence de cilostamide (Cil, 1 μM) est majoritaire, équivalente à 55 ± 5% de l’activité totale. L’activité de la PDE4, mesurée en présence Ro-20-1724 (Ro, 10 μM) est équivalente à 33 ± 2% de l’activité totale. L’utilisation d’un inhibiteur non sélectif, l’IBMX (100 µM) diminue l’activité totale de 91± 3%. Nous constatons que l’activité cumulée des PDE3 et PDE4 représente environ 83% de l’activité totale, ceci suggère que ces deux familles de PDE sont les principales à hydrolyser l’AMPc dans l’ACG.

Figure supplémentaire 1 : Activité PDE-AMPc dans les artères coronaires gauches de rat.

L'activité PDE-AMPc a été mesurée en présence de 1 μM [³H]-AMPc dans les lysats d’artères coronaires gauches. Le profil d’activité des PDE-AMPc a été déterminé en absence (activité totale) ou en présence de l’inhibiteur non sélectif des PDE, IBMX (100 µM) ou d’un inhibiteur sélectif d’une famille de PDE (PDE3 : Cil à 1 μM; PDE4 : Ro à 10 μM). Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM du % d’inhibition de l’activité totale. N = 4-6 expériences indépendantes réalisées sur des tissus récupérés de 13-23 rats.

0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 % inhibi tion of P DE a c tiv ity T ot a l c A MP P DE a c tiv ity (pmol /mg/ min) IBMX Cil Ro A ^B

119

2.2.2. Rôle des BK

Ca

dans la réponse relaxante induite par

l’inhibition de la PDE3 et PDE4 dans l’artère coronaire gauche

Les résultats présentés dans la figure 1 de l’article indiquent que l’effet relaxant de l’inhibiteur de PDE3 et de PDE4 est dépendant est aboli lorsque les canaux BKCa sont inhibés par l’IBTX.

- Etude du rôle de l’endothélium dans cette voie de signalisation

Comme de nombreuses voies endothéliales régulent le tonus vasculaire, nous avons évalué l’impact de l’élimination de l’endothélium sur l’effet relaxant des inhibiteurs de PDE3 et PDE4 ainsi que la conséquence sur le rôle des BKCa (Figure supplémentaire 2 ci-dessous). Nos résultats indiquent que le Ro n’a pas eu d’effet relaxant sur les artères pré-contractées alors que le Cil a induit une réponse vasorelaxante. Cette dernière est inhibée en présence d’IBTX, inhibiteur des BKCa. De plus, l’inhibition concomitante de la PDE3 et de la PDE4 induit une relaxation complète des artères pré-contractées, diminuée de moitié lorsque les BKCa sont inhibés.

Ces résultats indiquent que même si l’absence d’endothélium altère la réponse relaxante au Ro, elle n’altère pas l’importance des BKCa dans la réponse relaxante induite par l’inhibition du Cil seul ou en présence de Ro. Ceci suggère que le rôle des BKCa est indépendant de l’endothélium.

Figure supplémentaire 2 : Effet de l’inhibition des BKCa sur la réponse relaxante des inhibiteurs de PDE3 et PDE4 dans les segments d’ACG de rat dépourvus d’endothélium fonctionnel. L’inhibiteur de PDE3, cilostamide (Cil, 1 μM) et l’inhibiteur de PDE4

Ro-20-1724 (Ro, 10 μM) ont été appliqués séparément ou simultanément sur des segments d’ACG pré-contractés à l’U46619, en présence d’ibériotoxine (+, IBTX, 100 nM) ou de son véhicule (-). Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM (N = 4-6). * : P < 0,05 ; *** < 0,001.

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- Etude du rôle des K

v

et des K

ATP

dans l’effet relaxant de l’inhibiteur de

PDE3 et PDE4

Afin d’évaluer la contribution spécifique des BKCa dans la réponse relaxante aux inhibiteurs de PDE3 et PDE4, nous avons réalisé d’autres expériences de réactivité vasculaire en incubant les segments d’ACG avec un inhibiteur des Kv, la 4-aminopyridine (4-AP, 1 mM) ou un inhibiteur des KATP, le glibenclamide (Glib, 10 µM). La 4-AP ne semble pas altérer les réponses relaxantes au Cil et Ro, utilisées séparément ou de façon simultanée (Figure supplémentaire 3 ci-dessous).

Figure supplémentaire 3 : Effet de l’inhibition des Kv sur la réponse relaxante des inhibiteurs de PDE3 et PDE4 dans les segments d’ACG de rat. L’inhibiteur de PDE3,

cilostamide (Cil, 1 μM) et l’inhibiteur de PDE4 Ro-20-1724 (Ro, 10 μM) ont été appliqués séparément ou simultanément sur des segments d’ACG pré-contractés à l’U46619, en présence de 4-AP (+, 100 nM) ou de son véhicule (-).Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM (N = 3-4).

Même si les expériences réalisées en présence de Glib sont préliminaires (N = 2-5), il ne semble pas y avoir d’altération des réponses relaxante au Ro et au Cil ou au deux inhibiteurs simultanément (résultats non présentés).

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2.2.3. Rôle des BK

Ca

dans l’effet potentialisateur des

inhibiteurs de PDE3 et PDE4 sur la réponse

β-adrénergique

Après avoir évalué le rôle des BKCa dans la réponse relaxante du Cil et du Ro en condition de production basale d’AMPc (Figure 1), nous avons examiné leur rôle en situation de production stimulée d’AMPc (Figure 3). Nos résultats indiquent que l’inhibition des BKCa abolit l’effet potentialisateur du Ro et du Cil sur la réponse à l’ISO mais pas sur le L-85.

Comme l’activité des BKCa peut être modulée par les sparks calciques (Nelson et al., 1995), nous avons examiné leur implication dans la réponse β-drénergique (Figure supplémentaire 4 ci-dessous).

Les résultats indiquent que l’inhibition des sparks calciques par la ryanodine (Rya, 30 µM) diminue de façon significative l’efficacité de l’ISO (Emax contrôle : 83,31 ± 3,70% ; Emax Rya : 64,70 ± 5,3%, *** : P < 0,001) et abroge l’effet potentialisateur du Ro (Figure 10). Ces effets seront prochainement étudiés sur l’effet potentialisateur du Cil.

Figure supplémentaire 4 : Effet de l’inhibition de PDE4 sur la réponse relaxante induite par des concentrations cumulatives d’isoprénaline en présence de ryanodine (Rya) ou de son véhicule (control) sur des ségments d’ACG. Les courbes concentration-effet à

l’isoprénaline (ISO) (10-10 M – 10-5 M) sont réalisées sur des segments d’ACG incubés avec l’inhibiteur de PDE4 Ro-20-1724 (Ro, 10 μM, A) seul ou en présence de ryanodine (Rya, 30 µM, B) ou de leur véhicule respectif. Les pointillés en gris sur la figure B représente la courbe en condition contrôle. Les résultats sont exprimés en moyenne ± ESM de N = 8-11.

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Dans le document Exploration des mécanismes de régulation du tonus vasculaire par les phosphodiestérases des nucléotides cycliques et de leur altérations dans un modèle d'insuffisance cardiaque (Page 162-166)