1.4 Problématique
2.1.2 Protocole de contamination
Les études ont été menées à partir de rattes gestantes Sprague Dawley âgées de 12 semaines (Charles River, France). Les femelles arrivent à l’animalerie le lendemain de l’accouplement (stade E1) et sont reparties une par cage. Elles sont pesées à leur arrivée, puis une fois par semaine. Les femelles ont un libre accès à l’eau de boisson et à la nourriture. Elles sont soumises à un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h (éclairage de 8 heures à 20 heures). L’hygrométrie est stable et la température est main-tenue à 22˚C± 1˚C dans les pièces d’hébergement.
Les femelles gestantes sont exposées à l’uranium appauvri dès leur arrivée par ingestion d’eau de boisson contaminée, c’est-à-dire au stade embryonnaire 1 jour (E1). Elles sont reparties en 3 groupes de contamination : un groupe témoin (Evian), un groupe contaminé à l’uranium appauvri 40 mg/L et un groupe contaminé à 120 mg/L (figure 22). Au total, 120 femelles ont été contaminées. Ce nombre a été calculé en fonction du nombre d’embryons, de fœtus, de ratons et de rats nécessaire pour les expériences. Cinq stades de développement (1 stade embryonnaire, 1 stade fœtal et 3 stades postnatals) et à un stade à l’âge adulte ont été étudiés :
— les embryons et les fœtus sont exposés à l’uranium pendant les 13 (stade E13) et 18 (stade E18) premiers jours prénatals. Les nouveaux nés sont exposés à l’uranium jusqu’à la nais-sance (stade P0). Les animaux sont donc exposés à l’uranium pendant la gestation ;
— aux stades postnatals, les ratons sont exposés à l’uranium pendant la gestation puis par le lait maternel jusqu’à 5 (stade P5) et 21 (stade P21) jours après la naissance ;
— au stade adulte, les rats sont exposés à l’uranium pendant la gestation, la lactation et par ingestion d’eau de boisson jusqu’à l’âge de 2 mois (stade 2 mois).
Le stade E13 correspond au pic de formation des cellules Cajal-Retzius qui sont les premiers neu-rones du cortex à être générés. Au stade E18, les couches cellulaires du néocortex apparaissent et les neurones de la région hippocampique commencent à se former. À la naissance (P0), les cinq couches du neocortex sont formées. Les cellules granulaires du gyrus denté naissent pendant la pre-mière semaine postnatale, c’est pourquoi nous avons étudié le stade P5. Au stade P21, l’ensemble des structures du neocortex et de l’hippocampe sont formées. C’est un stade de transition entre le développement et le stade adulte. Le stade 2 mois correspond à un stade adulte jeune où le proces-sus de neurogenèse est encore actif au niveau du gyrus denté de l’hippocampe.
FIGURE22 – Protocole de contamination des animaux
À ces différents stades, nous avons réalisé des études : — histologiques, par coloration au crésyl violet ; — de prolifération cellulaire, par marquage au BrdU ;
— de mort cellulaire, par expression génique des principaux gènes impliqués dans le processus d’apoptose par la technique Fluorojade et par immunohistochimie de la Caspase 3 activée ; — de différenciation neuronale, par expression génique (RT-PCR) et par hybridation in situ de gènes impliqués dans le processus de différenciation neuronale et par immunohistochimie des marqueurs nestine, NeuN (neuronal nuclei) et doublecortine.
En parallèle de ces analyses que j’ai réalisées au cours de ma thèse, une étude a été menée au sein du laboratoire sur les animaux âgés de 21 jours et 2 mois. Une série de tests comportementaux clas-siques a été choisie dans un premier temps afin d’explorer de potentiels changements
comporte-mentaux (activités locomotrices et exploratoires, mémoire à court terme et dépression) chez les animaux contaminés à l’uranium.
L’activité locomotrice a été mesurée dans un actimètre (37 x 24 x 22 cm) équipé de deux rangées d’émetteurs à rayons infra-rouges situés à 5 et 9 cm de hauteur, mesurant les mouvements hori-zontaux et verticaux des animaux. L’actimètre permet de mesurer toutes les minutes, et ce pendant 20 min, les déplacements, ainsi que les redressements effectués par les animaux. L’activité explora-trice est étudiée par la mesure du nombre total de redressements (animal positionné sur ses deux pattes postérieures, droit, en équilibre dans le vide ou contre une paroi). L’activité locomotrice est étudiée par la mesure du nombre de mouvements horizontaux. L’actimètre est relié à un système informatisé qui compte le nombre de « coups », c’est-à-dire le nombre de fois où les faisceaux infra-rouges sont interrompus.
La mémoire à court terme est mesurée dans un labyrinthe en Y composé de trois banches identiques (13 x 4.5 x 5.5) disposées selon les médianes d’un triangle équilatéral. Les branches sont recouvertes de motifs distincts (ronds, triangles ou carrés). Les animaux sont placés dans le labyrinthe pen-dant 10 minutes, durant lesquelles sont répertoriées les branches visitées les unes après les autres. Un pourcentage d’alternances est calculé : 100 x nombre d’alternances positives/ nombre d’alter-nances possibles.
Le test de la nage forcée a été utilisé pour donner une indication sur le comportement de résigna-tion des animaux, une composante de l’humeur dépressif. Les animaux sont placés dans un bécher (40 cm de diamètre) rempli d’eau à 25± 0,5 ˚C pendant les 10 minutes. Les 5 premières minutes permettent l’habituation des animaux dans l’eau. Pendant les 5 dernières minutes, le temps d’im-mobilité des animaux, représentant le temps de résignation, est compté.
La répartition des animaux pour l’ensemble des expérimentations est résumée dans le tableau 3.
Les études expérimentales réalisées sur les animaux sont en accord avec les réglementations fran-çaise (ministère de l’agriculture Act No. 2001-464, Mai 2001) et européenne (Décret 86/609/EEC) imposant l’obtention d’une autorisation d’expérimenter sur les animaux vivants ainsi qu’avec le comité d’éthique de l’IRSN.
Les protocoles de l’ensemble des expériences seront décrits dans les articles de la partie résultats. Dans cette partie, seront détaillés uniquement les protocoles utilisés qui n’ont pas fait l’objet de publication.
Stade Femelles gestantes Embryons, fœtus, ratons ou rats adultes Total Mesure
d’UA (rein)
Total Mesure d’UA
Études immunohisto-chimiques Expression génique (PCR) Comportement E13 21 21 87 36 têtes et 12 embryons 15 15 E18 18 18 104 48 têtes et 17 fœtus 15 24 P0 15 15 87 24 (cerveaux et corps) 15 24 P5 15 15 87 24 (cerveaux et corps) 15 24 P21 24 24 96 24 (cerveaux et rein) 15 24 48 2 mois 27 27 96 24 (cerveaux et rein) 15 24 48
TABLEAU3 – Répartition des groupes d’animaux pour les expérimentations
Pour chaque stade, le nombre indiqué correspond à la somme des animaux témoins, contaminés à 40 et à 120 mg/L, chaque groupe de contamination contenant le même nombre d’animaux.