Un élément important de la pharmacologie de F508del-CFTR repose sur la constatation que F508del-CFTR ne peut fonctionner comme un canal chlorure qu‟une fois à la surface membranaire de la cellule (Denning et al., 1992 ; Namkung et al., 2005). Par conséquent, de nombreuses recherches moléculaires et pharmacologiques ont été engagées dans des approches visant à faciliter le ciblage membranaire de F508del-CFTR (Becq., 2010). Puisqu‟il est communément admis que la forme complètement glycosylée de CFTR est la seule forme de la protéine à être exprimée à la membrane plasmique, l‟efficacité de correcteurs potentiels est toujours évaluée par leur capacité à améliorer l‟accumulation de bande C (Roxo-Rosa et al., 2006).
Ainsi, en considérant ce contexte pharmacologique, notre objectif de recherche consistait à caractériser des composés non toxiques à la concentration d‟utilisation (10 µM), capables d‟induire
Page | 162 une restauration de la voie d‟adressage conventionnelle de la protéine au sein des compartiments intracellulaires (bande C) et une activité AMPc dépendante sensible à l‟inhibiteur sélectif de CFTR, le CFTRinh172. Parmi les 39 composés testés à ce jour, 3 montrent des résultats positifs pour ces trois
paramètres (SBC069, SBC040, SBC037) et 4 sont fortement suspectés (SBC079, SBC080, SBC018, SBC075). Seule la sensibilité à CFTRinh172 n‟a pas été testée pour ces derniers composés. Dans cette
étude, nous avons utilisé le VX809 comme composé correcteur de référence. Pour nos composés, les niveaux de correction atteints sont supérieurs à 50 % de la restauration fonctionnelle observée dans le cas d‟un traitement de F508del-CFTR par VX809. Les niveaux de maturation golgienne, par rapport à la quantité protéique totale, sont quant à eux de l‟ordre de 20 % à 40 % contre 69 % pour VX809. Cependant les niveaux de restauration mesurés (que ce soit en termes de maturation ou de fonctionnalité, Figure N°46 et Figure N°48) dans la condition F508del-CFTR traitée SBCs ou VX809 sont inférieures aux niveaux mesurés dans le cas de la condition non pathologique (WT-CFTR).
Concernant les résultats de maturation, nous devons anticiper que l‟effet de nos composés sur le contexte cellulaire peut être faible du fait de leur fixation potentielle dans une cavité de surface de la protéine plutôt qu‟une interaction avec des protéines engagées dans la voie de biosynthèse ou de dégradation et qui pourrait participer à l‟échappement du RE vers la voie de sécrétion.
Au vue de la stratégie de conception dirigée contre la cavité F508del-CFTR, des cinétiques d‟incubation (24 h de traitement, Figure N°54) et de correction (activité corrigée conservée pendant 8 h, Figure N°55) qui s‟apparente à ce qui est observé dans le cas d‟une correction de F508del-CFTR par VX809 (Van Goor et al., 2011 ), nous proposons que ces SBCs « leaders » soient de la classe des chaperonnes pharmacologiques de F508del-CFTR. (et notamment la classe C3 des fixateurs de F508del-CFTR, Boinot et al., 2014).
Ainsi, l‟introduction et la fixation des SBCs dans la cavité F508del-CFTR pourrait jouer un rôle de soutien à la stabilisation des interfaces défectueuses. Parmi celles-ci, l‟un de nos objectifs serait la stabilisation de NBD1/ICL4, interface suspectée comme étant altérée dans F508del-CFTR et à la base des défauts de repliement (Mendoza et al., 2012 ; Rabeh et al., 2012). Dans ce cas, la restauration d‟un repliement plus « physiologique » permettrait l‟échappement au système de contrôle qualité, une sécrétion vers le Golgi et l‟apparition d‟une population protéique mature. Cet échappement à l‟ERQC pourrait notamment être soutenu par l‟hypothèse selon laquelle un rétablissement structural de la protéine puisse masquer des sites d‟interactions de chaperonnes qui verraient la protéine poursuivre sa voie de sécrétion. L‟évaluation d‟effet possiblement potentiateur de l‟utilisation de nos composés sur des mutants « second site suppresseur » (cf. III.C.2.b chapitre
Introduction, p.70) couplés à F508del-CFTR tels que des mutants stabilisant NBD1 ou l‟interface
NBD1/ICL4 (respectivement F508del-R555K-CFTR (Teem et al., 1996) et F508del-R1070W-CFTR (Rabeh et al., 2012) pourrait apporter des éléments de réponse à ces questions de stabilité des
Page | 163 interfaces. Une récente étude révèle une action de VX809 dans les étapes précoces de la biosynthèse de F508del-CFTR en modulant la conformation de MSD1 et augmentant l‟efficacité des interactions entre MSD1 et NBD1, MSD2, NBD2 (Ren et al., 2013). En suspectant une action des SBCs dans la région de la cavité F508del-CFTR, il
serait tout à fait envisageable d‟imaginer une stratégie combinatoire avec VX809. Cette hypothèse est appuyée par des études préliminaires que nous avons réalisés sur ces mutants « second sites suppresseurs » afin de valider notre construction et qui montrent (i) qu‟une stabilisation des interfaces via ces mutations induit une restauration partielle de la réponse à l‟activation de F508del-CFTR et (ii) qu‟il est possible de potentialiser cette correction par l‟utilisation de VX809 (Figure N°56). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Mendoza ou encore Rabeh sur ces mutants (Mendoza et al., 2012 ; Rabeh et al., 2012 ). On peut donc imaginer qu‟en développant des
correcteurs de ces défauts de stabilité des domaines, on puisse combiner l‟action de VX809 afin de potentialiser la correction. De même qu‟au vue de nos résultats de pharmacologies combinatoires, il serait intéressant d‟envisager une combinaison des SBCs « leaders » avec le mélange à fort potentiel correcteur VX809+IsoLAB.
En effet, une partie de nos travaux suggère qu‟en combinant de manière appropriée des correcteurs ciblant divers acteurs de l‟adressage de F508del-CFTR, il est possible d‟optimiser la restauration fonctionnelle de ce mutant (Boinot et al., 2014). L‟étude de ces associations de correcteurs ouvre des perspectives nouvelles quant à l‟établissement d‟une pharmacologie additive pour restaurer l‟adressage et l'activité de la protéine F508del-CFTR.
Cependant, avant d‟appliquer cette stratégie combinatoire aux SBCs, il nous faudra comprendre les paramètres pharmacologiques de ces composés et leur action sur F508del-CFTR. De plus, pour le moment, les taux d‟activité mesurés montrent que cette restauration n‟est que partielle puisque éloignée de la valeur obtenue en condition non pathologique d‟une part et variable entre SBCs
Figure N°56 : Validation des mutants « second sites suppresseurs » sur cellules BHK transfectées en l’absence ou présence de VX809.
L‟activité des mutants est testée sur cellules BHK transfectées par la technique d‟efflux d‟iodure en présence d‟un cocktail Fsk 10 µM + Gst 30 µM ; n=4. La normalisation a été établie à partir de la valeur d‟efflux enregistrée pour la protéine sauvage (WT-CFTR). Les statistiques ont été réalisées par comparaison à la valeur du mutant F508del-CFTR par recours au test t de Student, ns : pas de différence significative, * : P<0,05, ** : p<0,01, *** : p<0,001. WT F508 del R555 K/F 508d el R107 0W/ F508 del R555 K/F 508d el R107 0W/ F508 del 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 *** *** VX 809 10 µM (k p ea k - k b as al ) m u ta n t F + G / (k p ea k - k b as al ) W T F + G
Page | 164 et non corrélée au taux de maturation d‟autre part (ex. SBC079 génère une réponse fonctionnelle de 91,9 % contre 69,9 % pour SBC080 pour une population protéique mature de 33,4 % pour SBC079 contre 39,52 % pour SBC080). Cette variabilité entre SBCs pourrait trouver son explication dans la variabilité de la nature des radicaux greffés au squelette chimique, notamment entre SBC079 et SBC080. Au regard de la structure et des composés fonctionnels (taille du noyau aromatique, longueur du bras espaceurs entre le squelette de base et le noyau), ne s‟agissant pour le moment que d‟intermédiaires de réaction, cette restauration partielle peut trouver son explication dans une intéraction partielle des SBCs dans la cavité voire une instabilité des contacts au moment de la dynamique de la protéine. Des études de dynamiques sont actuellement en cours dans les équipes partenaires de Paris et Grenoble afin de répondre à cette dernière question.
En attendant la synthèse de composés plus aboutis structurellement, il serait donc intéressant de poursuivre l‟étude des mécanismes de correction par le test de l‟impact de ces traitements sur le comportement de « gating » de la protéine F508del-CFTR corrigée (ex. expériences de patch-clamp en configuration canal-unitaire, configuration présentée en III.C.4.a et III.C.4.c chapitre Matériel et
Méthodes, p.113 et 114). De telles expériences permettraient l‟accès au nombre de canaux présents à
la membrane ainsi qu‟au cinétique d‟ouverture/fermeture (probabilité d‟ouverture, temps d‟ouverture et fermeture). En effet, si l‟analyse fonctionnelle effectuée sur F508del-CFTR a montré la restauration d‟une activité à des niveaux similaires à ce qui est observé dans le cas de VX809, l‟étude du profil de maturation révèle une population protéique mature présente en quantité inférieure. Cette absence de corrélation entre maturation et fonction (c'est-à-dire, pour une même activité mesurée un taux de maturation inférieur), outre l‟aspect purement structural de repliement et de contact entre les domaines, pourrait avoir plusieurs explications avec notamment une différence dans : (i) la quantité de protéine F508del-CFTR corrigée à la membrane, (ii) leur stabilité à la membrane ou leur cinétique de recyclage (« turnover » selon la terminologie anglo-saxonne), (iii) le « gating » de la protéine corrigée avec une différence de probabilité ou encore de temps d‟ouverture. L‟un des autres paramètres intéressant à étudier serait les conséquences de l‟incubation des SBCs sur la stabilité de la réponse à l‟activation de F508del-CFTR à température physiologique. Sommes-nous confrontés comme pour VX809 à une instabilité thermique de l‟activation de F508del-CFTR ou ces composés permettent ils le maintien de l‟activité à 37°C ?