Correction pharmacologique de la fonction et de la maturation du canal F508del-CFTR

Pour l'obtention du grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR des sciences fondamentales et appliquées

Laboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)

Secteur de recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie

Présentée par :

Clément Boinot

Correction pharmacologique de la fonction et de la

maturation du canal F508del-CFTR

Directeur(s) de Thèse : Frédéric Becq

Soutenue le 05 décembre 2014 devant le jury Jury :

Président Patrick Bois Professeur, STIM, Université de Poitiers

Rapporteur Valérie Chappe Professeure associée, Université de Dalhousie, Halifax, Canada Rapporteur Emmanuel Deval Chargé de recherche CNRS, Université de Nice-Sophia Antipolis Rapporteur Christophe Vandier Professeur, Université François Rabelais, Tours

Membre Frédéric Becq Professeur, STIM, Université de Poitiers

Membre Isabelle Callebaut Directrice de recherche CNRS, Université P. & M. Curie, Paris

Pour citer cette thèse :

Clément Boinot. Correction pharmacologique de la fonction et de la maturation du canal F508del-CFTR [En ligne]. Thèse Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie. Poitiers : Université de Poitiers, 2014. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>

Pour l‟obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS

(Faculté des sciences fondamentales et Appliquées

Diplôme national-Arrêté du 7 aout 2006)

Ecole doctorale : Ecole doctorale biologie-santé

– Bio-santé

Secteur de recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Présentée par

Clément Boinot

*****************************

Correction pharmacologique de la fonction et de la

maturation du canal F508del-CFTR

*****************************

Directeur de thèse : Pr. Frédéric Becq

*****************************

Soutenue publiquement le 05 Décembre 2014

devant la Commission d‟Examen

JURY

Valérie Chappe Professeure associée, Université de Dalhousie, Halifax, Canada Rapporteur Emmanuel Deval Chargé de recherche CNRS, Université de Nice-Sophia Antipolis Rapporteur Christophe Vandier Professeur des Universités, Université François Rabelais, Tours Rapporteur Isabelle Callebaut Directrice de recherche CNRS, Université Pierre & Marie Curie, Paris Examinateur Patrick Bois Professeur des Universités, Université de Poitiers Examinateur Frédéric Becq Professeur des Universités, Université de Poitiers Examinateur

A mes pipettes …

qui font de chaque patch une première rencontre

« La science est un jeu dont les règles consistent à trouver les règles du jeu »

Titre :

Correction pharmacologique de la fonction et de la maturation du canal

F508del-CFTR

Résumé :

a mucoviscidose est une maladie génétique autosomale récessive induite par des mutations du gène codant pour le canal chlorure CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Parmi les mutations les plus fréquentes, la délétion d‟une phénylalanine en position 508 conduit à un défaut d‟adressage de la protéine consécutif à sa rétention dans le réticulum endoplasmique. Bien que les mécanismes d‟action soient encore largement méconnus, de nombreuses petites molécules appelées correcteurs (VX809, SAHA, Corr4a, iminosucres…) ont été identifiées pour corriger individuellement le défaut d‟adressage et ainsi restaurer une partie de l‟activité de F508del-CFTR.

Dans une première partie, nous avons montré qu‟en combinant de manière appropriée ces correcteurs, il est possible d‟optimiser la restauration fonctionnelle de F508del-CFTR. Cependant, parmi ces composés, aucun ne présente de réels bénéfices cliniques. Ainsi, nous avons exploité les modèles de structure 3D de la protéine WT- et F508del-CFTR afin d‟identifier un site d‟intérêt (cavité F508del-CFTR) pour la conception de composés actifs et en particulier de correcteurs. Cette stratégie a conduit (1) à la conception de nouvelles molécules originales (2) à la synthèse de ces composés (3) à leur test sur la restauration fonctionnelle de F508del-CFTR. Les résultats obtenus par les techniques de Western-Blot, d‟efflux d‟iodure et d‟électrophysiologie ont permis de montrer qu‟il est possible, sur la base du modèle de structure 3D de la protéine et d‟expériences d‟amarrage moléculaire, de créer des molécules capables de restaurer les défauts d‟adressage et de fonctionnalité de F508del-CFTR.

Mots clés :

Summary :

ystic fibrosis (CF) is an autosomal and recessive disease due to mutations in the gene encoding a chloride ion channel CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Deletion of phenylalamine at position 508 leads to the most common mutation, resulting from a mistrafficking of the CFTR protein and its retention in the Endoplasmic Reticulum (ER), abnormal gating of CFTR channel and endocytosis. Numerous small chemicals called CFTR correctors (VX809, SAHA, Corr-4a, iminosugars…) have been shown individually - albeit partially – to restore F508del-CFTR defective trafficking and functionally rescue chloride transport default.

In previous studies, we showed that optimal combination of these correctors should lead to a more complete rescue of F508del-CFTR activity. Nevertheless, none of these correctors used show a good clinical issue. In a second set of experiments, based on models refinement of the open and closed forms of CFTR, we used molecular docking and virtual screening to identify new active molecules able to bind and interact with identified F508del-CFTR pocket. This strategy led to (1) design novel tailored correctors following molecular docking prediction, allow to bind specifically in F508del-CFTR pockets (2) synthetize these putative idealized compounds and (3) test them on the functional rescue of F508del-CFTR. Results showed, especially during Western-Blot combined to iodide efflux and patch-clamp experiments in whole cell configuration on F508del-CFTR cell that based on 3D structure model of entire CFTR protein, it is possible to develop new tailored correctors to target the root cause of CF.

Keywords :

Travaux réalisés au sein du laboratoire Signalisation et Transports Ioniques Membranaires (STIM), CNRS, ERL 7368, 1, rue Georges Bonnet, 86022 POITIERS cedex

Avant propos

Parce qu‟il me tenait à cœur de te donner la parole avant la bousculade scientifique…..

…Ce que j'attends des chercheurs, c'est forcément d'une part de trouver un remède, ce qui est normal pour une personne malade (pour toutes les maladies d’ailleurs) mais surtout qu'ils nous parlent de façon à ce qu'on puisse comprendre l'avancée des recherches…

« …Quand je lis des articles sur la recherche en général je lâche vite car pour moi c'est du chinois, heureusement que Fred nous explique ça plus clairement…

…Cette recherche prend un peu de place dans ma vie mais pas de trop car j'ai peur d'être découragé si je vois qu'elle n'avance pas. Je crois que c'est inévitable d'avoir des doutes sur le fait que l'on trouve un remède à temps avant d'arriver en fin de vie ou d'avoir perdu des personnes à qui l'on tient énormément. J’ai peur d'être découragé si ça prend trop de temps; être face au problème de ne plus avoir de médicaments auxquels je ne serais pas résistant au bout d'un moment. Ma joie est d'entendre mon pneumologue me dire "on va tester un nouveau médicament" ce qui veut dire pour l'instant qu'il me reste des alternatives. C'est aussi de voir que les choses avancent, même si j'ai une maladie qui a plusieurs mutations et que ce n'est pas pour la mienne qu'il y a des progrès. Ça prouve que ça avance quand même et que les efforts payent.

Jonathan, atteint de la Mucoviscidose

Homozygote F508del

Ces quelques lignes reflètent, si ce n‟est la complexité de la physiopathologie de la maladie, les attentes et l‟espoir que fondent les patients sur la découverte et le développement d‟un traitement curatif de la mucoviscidose. Malgré la découverte du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) il y plus de 20 ans et la multiplication des travaux de recherche, il n‟existe à l‟heure actuelle aucun traitement curatif s‟attachant aux causes de la pathologie.

L‟absence de production, la production d‟une protéine CFTR tronquée et/ou non fonctionnelle entraine une déshydratation et un épaississement du mucus qui ne va plus être éliminé et va stagner au niveau des voies aériennes. Il devient alors un terrain favorable au développement d‟infections bactériennes et aux altérations de l‟épithélium.

A l‟origine de la production d‟une protéine mal adressée et défectueuse, la délétion d‟une phénylalanine en position 508 de la protéine est l‟une des mutations à l‟origine de la forme grave de la maladie et concerne entre 70 % à 90 % des patients dans le monde. Bien que la mise sur le marché du Kalydeco constitue une formidable percée et une véritable révolution en offrant aux patients atteints de la mutation G551D-CFTR l‟espoir d‟une correction, elle ne concerne que 3-4 % des malades. La mutation F508del-CFTR cristallise le débat et est au centre de toutes les attentions. Il apparait donc primordial de poursuivre les efforts afin de découvrir de nouveaux composés à fort potentiel

correcteurs de cette mutation. Faire taire la maxime « l‟espoir ne meurt jamais » car au-delà de l‟espoir, il leur faut des solutions…

Les quelques lignes citées plus haut reflètent également les difficultés de vulgarisation à laquelle se heurte la recherche. Je fonde l‟espoir pour la suite du manuscrit, qu‟il puisse être accessible aux néophytes comme aux plus aguerris car cette recherche est aussi et surtout la leur. Merci Jonathan et Anne-Sophie et merci pour votre disponibilité…

Le travail de recherche présenté tout au long de ce manuscrit a été réalisé sous la direction du Pr. Frédéric Becq, au sein du laboratoire Signalisation et Transports Ioniques Membranaires (STIM, ERL 7368 / CNRS) dont il est le directeur.

Mes travaux font l‟objet d‟un soutien financier de l‟association « Vaincre La Mucoviscidose » et prennent part à un consortium nommé « Fonctions et modulateurs de fonction de CFTR ». Ce projet de recherche est coordonné auprès de l‟association par le Dr. Isabelle Callebaut, directeur de recherche à l‟Institut de Minéralogie, de Physique des Matériaux et de Cosmochimie à Paris (Université Pierre et Marie Curie - UMR7590 / CNRS). Au niveau local, ces travaux s‟inscrivent dans la thématique de recherche développée par l‟équipe « Transports Ioniques et Mucoviscidose » dirigée par le Pr. Becq.

…Si je devais ne retenir qu’une citation "souris à la vie et la vie te sourira" tout simplement parce que si on prend les choses avec le sourire, les bonnes comme les mauvaises nouvelles, elles sont toujours plus facile à accepter et que si on fait des efforts pour sourire et accepter les bonnes comme les mauvaises nouvelles, les efforts payeront forcément à un moment ou à un autre… »

Remerciements

Tout au long de ces trois années de thèse, j‟ai appris à dompter et intégrer une phrase désinvolte jetée par-dessus l‟épaule par un professeur à mon entrée à l‟université… et qui a souvent marché à mes côtés durant ces trois années de thèse « ce n‟est pas un sprint mais une course de fond ». Puisque vous m‟avez tous appris à votre échelle à mettre un pied devant l‟autre, courir, adapter mon souffle et endurer, je vous laisse volontiers la lumière l‟espace de quelques lignes. Puisque nous ne sommes rien sans les autres, leur regard, leur conseil, une belle pièce ne se construit jamais seul et c‟est avec de tout petit rien que l‟on peut espérer prétendre à un grand tout… Je ne sais si cette pièce s‟est jouée au sein d‟un petit village de campagne ou sur les planches de Broadway, mais cette pièce a été la mienne, faite de bonheur, de déception, tristesse et doute, je ne sais dans quelle catégorie elle se place, ovni à la fois comique et tragique mais toujours dirigée avec passion.

Une pièce se doit d‟être évaluée par la « critique », Je remercie tout d‟abord Mme le Dr. Valérie Chappe, Mr le Dr. Emmanuel Deval et Mr le Pr. Christophe Vandier pour avoir accepté d‟être les rapporteurs de ce manuscrit. J‟associe à ces remerciements Mme le Dr. Isabelle Callebaut et MM les Pr. Patrick Bois et Frédéric Becq pour avoir accepté de juger ce travail et me faire l‟honneur de participer à mon jury de thèse. J‟espère ne pas vous décevoir, et nourris secrètement celui que mon travail puisse piquer votre curiosité et être à la hauteur du niveau d‟étude auquel je postule.

Dans une pièce de théâtre, on a tout d‟abord le metteur en scène, celui qui chapote, règle le jeu d‟acteur, tantôt critique, tatillon parfois, professionnel souvent… Fred…Avant tout, je te présente mes plates excuses pour tous ces cheveux blancs que j‟ai dû te donner au cours de cette rédaction et avant d‟ailleurs, toutes ces phrases alambiquées, à rallonge et cette art de noyer l‟information. Les médecins m‟ont diagnostiqué une sorte de malfoutose synthétique dans mes phrases mais entre nous un homme poivre et sel, ça a du charme =). Plus sérieusement, merci pour ton soutien, ta confiance, l‟opportunité que tu m‟as offerte, tu as été un metteur en scène qui m‟a laissé une liberté totale, merci de m‟avoir fait entrer dans le monde de la muco et de nous avoir offert à tous l‟opportunité des congrès et autres rencontres scientifiques qui dilatent les pupilles et ouvrent de nouvelles perspectives. J‟ai appris la passion et la rigueur scientifique à tes côtés, l‟ambition aussi, j‟ai des défauts à régler, merci pour ta sincérité et ta franchise, ta bienveillance, tu te devais d‟être un mentor, un père parfois et tu as été ma « bonne mère » (à prononcer avec l‟accent marseillais bien sur…) alors juste pour tout ça, merci…et si je nourris un regret, celui de ne pas t‟avoir côtoyé comme je l‟aurais voulu, entre tes responsabilités et mon respect maladif, on est en apprentissage permanent…et je n‟arrive

toujours pas à décoder le Fred, sauf celle-ci…Car c‟est aussi ça, LE BOSS, ce petit côté espiègle en rentrant dans son bureau les épaules frétillantes de rire après une bonne blague…

Autre élément essentiel d‟une bonne pièce de théâtre pour ne pas flancher, à qui s‟accrocher, se raccrocher en cas d‟oubli de texte, le souffleur, pardonnez-moi dans mon cas les souffleuses, car elles étaient aux nombres de deux…

Caroline, ce qui est embêtant avec toi Caro comme avec Clarisse d‟ailleurs, c‟est encore un remerciement qui va prendre dix lignes…Certes, à côté de la boute en train tout sourire, pétillante et bonne vivante que tu es, se cache une scientifique redoutable. Merci pour m‟avoir fait entrer dans le monde merveilleux de la pharmacologie, merci d‟avoir été là pour moi, d‟avoir veillé sur nous de ton regard bienveillant autant que critique (attention !!! dans le bon sens du terme, celui qui te fait te poser les bonnes questions et avancer) mais aussi et surtout protecteur, merci de m‟avoir poussé à me remettre en question et remonté à cheval une fois tombé. Je n‟oublierai pas tes yeux endormis le matin, pétillant le soir, et les couvercles de plaques qui s‟accumulent sur ton bureau, et promis avant de partir j‟endosserai une dernière fois ma tenue de coureur…

Clarisse, merci pour toutes ces discussions, scientifiques ou non, j‟ai énormément appris à tes côtés, le single, la rigueur scientifique, la remise en question, le dépassement de soi, tu as veillé sur moi dans l‟ombre de ton bureau et m‟a aidé à avancer, j‟ai aimé passer du temps avec toi, j‟ai aimé te voir pousser la porte de patch pour venir aux nouvelles, tu m‟as accordé du temps et de l‟importance, j‟ai aimé échanger, discuter et apprendre chaque jour d‟avantage et en tout cela merci, reste une « Vachement » grosse accolade à venir avant la fin…

Viennent ensuite les acteurs sauf que dans cette pièce il n‟y a pas eu de second rôle…

Thierry, toujours un mot gentil, un clin d‟œil, un encouragement, un sourire au quotidien, c‟est drôlement précieux et quand tout cela est fait avec l‟accent chantant =) Ta vivacité d‟esprit, ta vision de chef d‟entreprise ont toujours visé dans le mille et force est de constater que tes conseils sont toujours avisés.

Un remerciement tout particulier à l‟ensemble des membres du consortium, nous ne sommes qu‟au commencement du travail, le bébé est né, à nous de le faire grandir et d‟en faire un homme bien. Merci Isabelle, Jean-Paul et Brice, de m‟avoir initié au monde de la modélisation, c‟est vraiment fascinant, souvent pointu, parfois inaccessible mais votre passion est communicative. Merci Pierre pour ta vision et tes remarques, j‟espère que tu ne m‟en voudras pas pour les termes, mais croiser un « jeune dinosaure » au verbe acéré, au sourire ravageur, un brin charmeur et en même temps si charismatique, ça fait prendre 10 ans d‟expérience en un an. Merci Jean Luc, Antoine, Ben et Romain pour toutes ces molécules, je trépignais d‟impatience d‟ouvrir les cadeaux que vous m‟envoyez régulièrement à la recherche DU composé, j‟espère avoir été à la hauteur, show must go on !!! Christophe, à toi le flambeau à présent…

Jojo, ouaaaaaaa, Jojo en présentation c‟est juste une claque !!! Même si tu ne bois pas trop d‟alcool, tu es bourré de qualités =), professionnelle et humaine bien sûr. J‟ai beaucoup appris à ton contact, ton calme n‟a d‟égal que ta gentillesse et ton petit Louis deviendra un Roi. Certes la royauté est abolie, à défaut de devenir roi de France il est prince en ton royaume.

Laurie-Anne, bien que tu ne sois plus au labo, tu as pailleté notre vie et nous a ouvert la voie, merci pour ton sourire, les musiques pourries du vendredi, les délires et le soutien, franchement je suis vraiment triste et désolé d‟avoir cassé ta poule mais je pensais sincèrement qu‟elle déploierait ses ailes =) comme tu l‟as si bien fait, j‟ai aimé évoluer et grandir à tes côtés, ce fut un plaisir.

Mathilde, tu m‟as initié à bon nombre de techniques et fait découvrir les joies de la mutagénèse, tu m‟as appris combien il est important de travailler dans un espace rigoureux et pour quelqu‟un comme moi c‟est un travail de tous les jours. Merci pour ta patience et ta gentillesse car je crois que je n‟ai pas dû être un cadeau =) Je te souhaite énormément de bonheur dans ta vie.

Khadidja, bon je sais que mon départ te brisera le cœur et j‟en suis désolé =) mais tu me détestes autant que tu m‟aimes, avoues le =) ce fut un immense plaisir tous ces Western partagés, toutes ces plaques de verres cassés, le chambrage, je te laisse mon marqueur noir pour que tu t‟améliores lorsque tu révèles un Western =), plus sérieusement, ce fut un plaisir, et je sais que derrière cette petite carapace se cache un petit cœur tendre, plein de bonheur pour ta thèse, mais je ne me fais pas de soucis pour toi !!! et un petit conseil, ne passe pas ton permis sinon tu ne prendras plus le bus =).

Romain, je ne saurais exprimer toute mon admiration, si je veux être un post-doc c‟est toi !!!=), mélange de gendre idéal, scientifique hors père (enfin si, père de deux enfants) avec des valeurs humaines au-dessus de la moyenne et ce petit trait d‟humour citronné (avec la meringue Monsieur) qui laisse les femmes du labo empourprées…tu m‟as ouvert les yeux et initié au monde du routage de CFTR et du Western, un mec comme toi dans un labo, ça n‟a pas de prix…et je n‟oublierai pas ton geste…

Un merci également à une personne qui fut ma costumière et a habillé mon quotidien pendant 3 ans… « Le plus grand bien que l‟on puisse faire à quelqu‟un est de lui révéler sa richesse », j‟ai l‟espoir d‟y avoir un petit peu réussi. Il ne me reste qu‟à te souhaiter une belle route à dos de Licorne, be happy Laura.

Ah j‟oubliais l‟une des responsables son et lumière…Sandra, espèce de tornade black qui décoiffe, mes boucles s‟en souviennent encore, mes fesses aussi remarque =) !!!!!! Merci pour tes blagues, les discussions potaches, ton attention et tes petits plats, j‟ai passé de très bons moments et mes zygomatiques m‟étaient parfois douloureux, je te demanderai juste une chose, s‟il te plait

prononce moi rhododendrons =) et commande moi de lacrylamide =). J‟associerai aussi Jenny et sa franchise, son intégrité, un petit bout de femme qui sait où elle va =)…

Merci David, Zhiwei et toute l‟équipe de Bristol, ce mois passé à vos coté fut riche d‟enseignement, d‟humilité et de passion, j‟admire décidément ce flegme si anglais et cette générosité dans les regards et les échanges.

Comme disait Coluche, une bonne pièce ne fait un malheur que quand elle procure de petits bonheurs au public…Alors ce public je le remercie…

Greg, on n‟avait pas eu trop l‟occasion de se côtoyer durant les études, merci de ta présence durant la thèse, merci pour nos réflexions d‟apprentis physiologistes, nos échanges Deux-Sévriens sur le foot district, ton sourire et ce côté chambreur, ta « relation » avec Christophe a ponctué mon quotidien, tu as fait vraiment du super travail durant ta thèse, en même temps je ne suis personne pour le juger, mais je tenais à le dire…

Babeth, j‟admire ton abnégation et ta passion. Tu es dans une situation délicate mais tu t‟en sors avec brillot, et vu tes qualités je ne me fais pas de souci pour toi, un immense merci pour ton soutien et tes conseils.

Merci à tous ces regards croisés dans l‟assemblée, ces mains tendues, ce soutien au quotidien, Christophe (tu as percussionné ma thèse et toujours pris soin de nous, un mot simple et doux, juste un mec bien), Thomas (blagues, échanges scientifiques, WB canons, discussions potaches et repas partagés, autant de petites parenthèses inattendues), James (funambule des ordinateurs, merci pour ta patience et ton sourire), Christelle et Carole, vos sourires et votre patience sont d‟or, Hélène (j‟ai aimé nos discussions et ta vision de la vie, merci d‟avoir été là), Mathilde et Audrey (une vrai bouffée d‟oxygène) les coureurs fous Denis (tu vas me manquer et tous nos kms aussi) et Micka =), les pontes dont on ne sait jamais si on doit les tutoyer ou les vouvoyer mais qui ont toujours pris le soin de demander comment ça allait et prendre des nouvelles, Jean François (vous), Jocelyn (tu), la camarade Brigitte (tu), et Patrick (vous/tu), c‟est un honneur Messieurs, Mesdames….Merci à Christian et Stéphane pour vos sourires ainsi qu‟à l‟ensemble des membres de STIM.

Bien qu‟une thèse soit un processus professionnel et scientifique, je veux m‟arrêter quelques lignes sur une autre sorte de public, celui acquis à notre cause avant même le début de la représentation mais avec lequel on s‟applique tout autant.

Je n‟oublie pas l‟équipe de PhysioStim, Marie, Richard, Hélène, Jeoffrey, Stéphanie et Ludo, toujours un mot gentil et un soutien, on se reverra, c‟est une promesse et merci à celui qui m‟a appris à patcher Simon, sans toi, trop nombreuses auraient été les pipettes à tomber sous le coup du micromanipulateur….

Sylvain, j‟ai découvert avec toi que le génie existait, il y a les hommes normaux, simples mortels, ni bon ni mauvais, et il y a ceux qui appartiennent à une autre catégorie…les extraterrestres, les mecs qui nagent 3 kms en tractant leur copine dans un bateau gonflable, qui gèrent études de médecine, ironman et thèse avec une humilité déconcertante et qui ont un cœur si gros que s‟il le donnait pour un don d‟organe on pourrait transplanter, au bas mot, 10 patients !!!! Ta gentillesse, ta simplicité, ta vison de la vie, ton rapport aux autres, m‟ont à jamais marqué !! La vie est faite de rencontres et tu as une reine à tes cotés ;)

Isa et Bruno, comment ne pas vous admirer, admirer votre combat et votre force, vous gardez une place particulière dans mon cœur et les aléas de la vie n‟auront pas sa peau…décidément j‟arbore toujours mon sourire niais à me remémorer les soirées partagées avec les parents =)

Et les amis de longues dates Bertrand (je n‟oublierai jamais nos TP, un vrai frère d‟armes et de cœur, j‟ai énormément appris à tes cotés, sur les hommes et la vie et pour ça merci, tu m‟as aussi appris que les amis sont toujours là aussi bien dans les périodes de joie que de tristesse et je ne l‟oublierai jamais, tu me manque déjà, je suis extrèmement heureux de faire parti de votre vie, je te dois une immense part de cette « réussite » et celle-ci est aussi la tienne), May (Merci pour ta spontanéité, ta fraicheur et ton sourire), Dude (j‟ai enfin retrouvé ma caisse, merci d‟avoir été et d‟être encore et toujours là Nico), Nico, Cécile, Aude, Laura (que dire que vous ne savez déjà), merci Ienien et les nouveaux Gael, Eric, Steph, Seb, Antho, Arno, le Stade, il y en a vraiment trop et je vais me faire taper sur les doigts, juste merci…..Eva et Adeline, ce fut un réel plaisir de croiser votre route…

Alex, Nathan, Nadine et Etienne, dans un livret de famille, on en a qu‟une mais si je pouvais en ajouter une autre…Merci pour votre soutien, votre regard, ces moments inoubliables, ces sourires, cet amour, je vous admire, vous aime et vous dois tant sinon une très grande partie du tout !

Et parfois en parcourant le public dans un moment de doute et de perte de confiance, à la recherche d‟un nouveau souffle, pour se ressaisir et tenir son rôle, on trébuche sur un bonus, sur un de ces moments inattendus en croisant un regard, un sourire venu du pacifique qui vous touche, vous découvrez alors que ce sourire peut illuminer vos journées, merci pour ton soutien et pour m‟avoir tenu debout face au vent en cette fin de thèse, l‟avenir nous attend et franchement il affiche de très belles promesses (Like a bird louiz).

Maryse et Martine, un merci particulier pour le temps, la patience et la gentillesse avec laquelle vous avez accepté de relire ce manuscrit.

La vie est faite de modèles, l‟un des miens grimpe aux arbres, l‟autre veille sur lui….Papa, sache que la valeur d‟un Homme ne se mesure pas aux années d‟étude que compte son CV, tu as de l‟or dans les mains, dans les yeux et dans le cœur et ça ça n‟a pas de prix….Maman, petit fantôme invisible qui veille sur moi et m‟accompagne, j‟ai grandi dans les arbres et la sciure, mais tes mains et

ta sensibilité m‟ont façonné, tu es la lumière quand la nuit arrive, je ne saurais comment vous exprimer toute mon admiration. Et puisqu‟une main comporte cinq doigts, il en manquait deux…Nico et Val, grandir à vos côtés a fait de moi l‟homme que je suis, ce n‟est pas à moi de juger du résultat mais en tout cas je vous remercie d‟avoir toujours été présents, de m‟avoir soutenu et poussé à me dépasser, et puisque cette pudeur maladive et parfois puérile nous empêche souvent de le dire, je vous aime. Si au commencement on m‟avait demandé de choisir une famille, j‟aurais choisi la votre… et bien qu‟un océan séparera nos bras, mon cœur restera rivé à votre port, je vous dois tout et plus encore…Dédicasse aux mamies aussi, cousines et cousins, oncles, tantes, bref tout le monde quoi =) et Chris, je ne vous oublie pas ;)

Un merci tout particulier à l‟association « Vaincre La Mucoviscidose », ma vie n‟est plus la même depuis que vous y êtes entré, je ne pourrai jamais exprimer toute ma gratitude et mon admiration pour votre combat qui est devenu le mien, à ma petite échelle, je vous dois tant et j‟espère être digne de vos couleurs, en tout cas je m‟y applique et m‟y appliquerai, même au pays de l‟oncle Sam.

Page | 1

Sommaire

SOMMAIRE

1

TABLEAUX ET FIGURES

6

LISTE DES ABREVIATIONS

9

INTRODUCTION

11

B. Du gène à la biosynthèse de la protéine CFTR 13

1. Le gène 13

2. La protéine 14

a. CFTR, un membre de la famille des transporteurs ABC 14

b. Structure 15

3. Des différents domaines à la fonction de CFTR 16

c. Structure du pore, MSD1 et MSD2 17

d. Les boucles extracellulaires (ECL) 18

i. ECL et influence sur l‟activité du canal 18

ii. ECL et maturation de la protéine 19

e. Les boucles intracellulaires (ICL) 19

i. ICL , un lien fonctionnel 19

ii. ICL et maturation de la protéine 20

f. Les domaines de liaison aux nucléotides, NBD1 et NBD2 20

i. Localisation 21

ii. Structure et fonction 21

g. Domaine régulateur R 22

i. Localisation 22

ii. Structure et fonction 23

h. Les extrémités de la protéine 23

i. Extrémité NH2-terminale 23

ii. Extrémité COOH-terminale 24

C. Modèles d‟études et modélisation 24

D. Biosynthèse de la protéine et expression membranaire 26

1. Biosynthèse et assemblage 26

a. Assemblage des domaines et entré dans la voie de sécrétion 26

b. Contrôle qualité et adressage 28

i. Etapes de maturation pré-golgienne 28

ii. Formes associées à la maturation 29

2. La voie de dégradation réticulaire 31

a. Au moment du repliement 31

b. En sortie de cycle de la calnexine 31

3. Adressage de CFTR du RE à la membrane plasmique 31

Page | 2

F. Activité de CFTR 33

1. Phosphorylation, pré requis à l‟activation de CFTR 33

2. Fixation de l‟ATP et hydrolyse, ouverture/fermeture du canal 34 G. Modulateurs de fonction et régulation pharmacologique : 35

1. Activateurs de CFTR : 35

a. Activateurs indirects 36

b. Activateurs directs 37

2. Inhibiteurs 38

H. CFTR, une protéine régulatrice 40

1. Un carrefour de conductances 41

2. La route du chlorure 42

a. Membrane basolatérale 42

b. Membrane apicale 43

I. Fonction de CFTR au sein des tissus épithéliaux 43

1. Les tissus épithéliaux 43

2. Rôle physiologique de CFTR et impacts physiopathologiques 43

II. F508del, une mutation de CFTR 45

A. Une même pathologie, des mutations 45

1. Classe I, mutations altérant la production de la protéine 45 2. Classe II, mutations perturbant le processus de maturation de la protéine 45 3. Classe III, mutations affectant la régulation de la protéine et sa fonction de canal Cl- ₄₆

4. Classe IV, mutations altérant la conduction du canal Cl- ₄₇

5. Classe V, réduction de la synthèse protéique 48

6. Classe VI, mutations altérant la stabilité de la protéine mature à la membrane 48

B. F508del-CFTR 49

1. F508del vs WT-CFTR, des similarités 50

2. F508del vs WT-CFTR, des conséquences multiples 50

a. Défauts structuraux 50

i. NBDs et destabilisation de NBD1 51

ii. Rupture des interactions NBD1/ICL4 52

b. Défauts de la voie de biosynthèse 53

i. Adressage 53

ii. Localisation et stabilité à la membrane 55

c. Défaut de fonctionnalité, l‟enjeu du gating 56

d. Instabilité thermique 58

III. Pharmacologie de la mucoviscidose 59

A. Au commencement, la thérapie génique 59

B. G551D et la naissance d‟une pharmacologie de la mucoviscidose 61

1. G551D, une autre mutation de CFTR 62

2. La démarche pharmacologique 62

a. IBMX et dérivés des xanthines 62

b. Importance de la balance phosphorylation/déphosphorylation, la piste des inhibiteurs des

phosphatases 64

c. Flavones/Isoflavones, la génistéine premier potentiateur de CFTR 66 3. VX770, première molécule commercialisée pour la mucoviscidose 67

C. Pharmacologie de F508del-CFTR 69

1. Une pharmacologie plus complexe 69

2. Des cibles multiples, une classification 69

a. Protéines chaperonnes et système de dégradation protéolytique 69 b. La protéine F508del-CFTR et mutations « second sites supresseurs » 70

Page | 3

1. Classe C1, 2, 3 : Chaperonnes pharmacologiques 73

a. Classe C1, stabilisateurs des interfaces NBD1/ICL1, NBD1/ICL4 : VX809 73

b. Classe C2, fixateur NBD2, Corr4a 74

c. Classe C3, fixateur NBD1 75

2. Classe C4 : Modulateurs protéostasiques 75

3. Classe C5 : Potentiateurs, VX770 76

4. Pharmacopée de la correction de F508del-CFTR 77

E. Vers une stratégie de pharmacologie combinatoire de F508del-CFTR 78 F. Du criblage de chimiothèque à la conception de correcteurs 79

CONTEXTE DE L’ETUDE, PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS

81

I. Axe 1 : Recherche de combinaisons de correcteurs pour optimiser la restauration des défauts liés à

F508del-CFTR. 82

A. Contexte scientifique et objectifs 82

B. Notre schéma expérimental 84

II. Axe 2 : Evaluation et validation de nouveaux modulateurs de F508del-CFTR 84

A. Contexte scientifique et objectifs 84

B. Criblage des SBCs comme correcteurs de l‟adressage et de l‟activité de la protéine F508del-CFTR 87

MATERIEL ET METHODES

88

I. Matériel Cellulaire : 88

A. Lignées cellulaires : 88

1. Lignées HeLa 88

2. Lignées BHK-21 89

3. Lignées CFBE41o- transfectées F508del-CFTR 89

B. Congélation/décongélation des cellules : 90

C. Culture cellulaire : 90

1. Entretien des lignées et repiquage cellulaire : 90

a. Composition des milieux de culture 90

i. Milieu de culture des cellules HeLa 90

ii. Milieu de culture des cellules BHK 91

iii. Milieu de culture des cellules CFBE transfectées F508del-CFTR 91

b. Entretien des lignées et repiquage 91

2. Système d‟expression hétérologue : 92

a. Plasmide pEGFP-C1 : 92

b. Mutagénèse dirigée, construction du transcrit: 93

c. Transfection : 94

d. Protocole de transfection 95

3. Traitements pharmacologiques appliqués aux cellules 95

II. Techniques de biochimie : 96

A. Test de viabilité cellulaire, test MTT : 96

1. Principe : 96

B. Western-blot : 97

1. Principe : 97

2. Préparation des échantillons : lyse cellulaire, extraction protéique et dosage (fiche protocole, Chapitre

Annexe section I.B) : 99

3. Electrophorèse et transfert 100

Page | 4

5. Quantification et analyse : 102

III. Techniques de physiologie cellulaire : 103

A. Etude des variations du potentiel de membrane : 103

1. Principe : 104

2. Protocole de charge 104

3. Acquisition des données et analyse des résultats : 105

B. Efflux d‟iodure : 106 1. Principe : 106 2. Méthode d‟analyse : 107 C. Patch-clamp : 108 1. Introduction : 108 2. Principe : 109

3. Méthode de réalisation du « seal » ou scellement membranaire : 111

4. Différentes configurations : 112

a. Cellule attachée : 113

i. Principe : 113

ii. Quels types d‟enregistrements ? 113

b. Cellule entière : 113

i. Principe : 113

ii. Quels types d‟enregistrements ? 114

c. Membrane excisée : 114

i. Principe : 114

ii. Quels types d‟enregistrements ? 115

5. Quelques notions électriques de la configuration cellule entière 115

6. Dispositif expérimental : 117

a. Set-up, poste de travail : 117

b. Cellules, pipettes et solutions de patch : 118

i. Préparation biologique : 118

ii. Pipettes de patch : 119

iii. Usinage de la pipette : 119

7. Protocoles et méthode d‟analyse : 121

8. Evaluation statistique des résultats : 122

RESULTATS

123

I. Chapitre 1 : Recherche de combinaisons de correcteurs visant à potentialiser la restauration des

défauts liés à F508del-CFTR. 123

A. Contexte bibliographique 123

B. Article scientifique 124

C. Résumé des principaux résultats de l‟article 136

1. Introduction à l‟instabilité thermique 136

2. Bilan des principaux résultats 136

D. Perspectives 137

II. Chapitre 2 : Evaluation et validation de nouveaux modulateurs de F508del-CFTR 139

A. Contexte bibliographique 139

B. Etat de maturation du projet 141

C. Résultats 142

1. Preuve de concept 142

a. Synthèse chimique 142

Page | 5

c. Effets des SBCs sur la toxicité cellulaire 143

d. Criblage fonctionnel : Restauration d‟une conductance chlorure AMPc dépendante 146 e. Restauration du profil de maturation de F508del-CFTR 150 f. Bilan de la stratégie GO/NO GO et sélection des composés « leaders » 152

2. Des composés « leaders » 155

a. Caractérisation de la correction, évaluation de la valeur d‟EC50 155 b. Analyse fonctionnelle des courants Cl- _{F508del-CFTR corrigé par les SBCs « leaders » 156}

3. Cinétique de correction 158

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

161

I. Correction de l’activité F508del-CFTR associée à une population protéique mature 161

II. Correction d’une activité F508del-CFTR par une population protéique immature 164

III. Des questions en suspend 166

IV. Synthèse du projet et perspective expérimentales globales 168

ANNEXES

171

I. Matériel et méthodes 171

A. Facteur de transcription 171

B. Protocole de Western-Blot 172

II. Résultats complémentaires 174

A. Impacts des SBcs sur la viabilité cellulaire 174

B. Criblage fonctionnel : Restauration d‟une conductance chlorure AMPc dépendante 180 C. Etude de l‟impact des SBCs sur la maturation de la protéine F508del-CFTR 182

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

185

LISTE DES COMMUNICATIONS

216

CURRICULUM VITÆ

218

I. Expérience professionnelle : 218

II. Compétences techniques : 219

III. Formation : 219

Page | 6

Tableaux et figures

Tableau N°1 : Liste non exhaustive de quelques activateurs de la protéine CFTR avec leur mécanisme

d‟action potentiel. ... 38

Tableau N°2 : Liste non exhaustive de quelques inhibiteurs de la protéine CFTR avec leur mécanisme d‟action potentiel. ... 40

Tableau N°3 : Canaux ioniques présents à la surface des épithéliums et régulation potentielle par CFTR. ... 42

Tableau N°4 : Liste non exhaustive de quelques correcteurs et potentiateurs utilisés en pharmacologie de F508del-CFTR. ... 77

Tableau N°5 : Descriptif de l‟ensemencement cellulaire pour chacune des lignées en fonction de la technique utilisée. ... 92

Tableau N°6 : Composition du tampon de lyse cellulaire utilisé pour l‟extraction protéique. ... 100

Tableau N°7 : Composition des tampons 4X pour les gels de séparation et de concentration. ... 100

Tableau N°8 : Composition des gels d‟électrophorèse, éléments polarisants ajoutés extemporanément. ... 100

Tableau N°9 : Composition du tampon TG-SDS 10 X. ... 101

Tableau N°10 : Anticorps primaires et secondaires utilisés, dilués dans PBST comme indiqué. ... 102

Tableau N°11 : Composition du milieu extracellulaire d‟oxonol ... 105

Tableau N°12 : Perspectives expérimentales globales pour la partie fonctionnelle du projet « Fonction et modulateurs de fonction de CFTR » et faisabilité au sein de l‟équipe. ... 169

Figure N°1 : Physiopathologie de la mucoviscidose, du gène aux atteintes physiologiques. ... 13

Figure N°2 : CFTR, du gène à la protéine. ... 14

Figure N°3 : Exemple type d‟une étude de recherche d‟homologies par analyse de séquences (ici les régions de TM5, 11, 6, 12 et ECL 3 et 6) entre différents transporteurs ABC (en bleue). ... 15

Figure N°4 : Représentation schématique de la protéine CFTR... 17

Figure N°5 : Modélisation des MSDs et de la face extracellulaire du pore... 18

Figure N°6 : Modélisation des domaines de fixation des nucléotides. ... 22

Figure N°7 : Structures tridimensionnelles connues de 4 transporteurs de la famille des transporteurs ABC. ... 25

Figure N°8 : Repliement de CFTR et assemblage des domaines. ... 27

Figure N°9 : Assemblage et repliement de CFTR au sein du système de contrôle qualité du reticulum endoplasmique (ERQC). ... 29

Figure N°10 : Protéine CFTR sauvage. ... 30

Figure N°11 : Changements de conformation de la protéine CFTR au cours de son activation et des phénomènes d‟ouverture/fermeture du canal. ... 35

Figure N°12 : CFTR, chef d‟orchestre de la régulation des conductances ioniques épithéliales. ... 41

Figure N°13 : Impact de deux mutations de classe III (G551D- et G1349D-CFTR) sur les paramètres de « gating » de du canal. ... 47

Figure N°14 : Classification des différentes mutations du gène CFTR et conséquences sur la voie de biosynthèse de la protéine. ... 49

Figure N°15 : Changements structuraux locaux à la surface des interfaces entre les domaines, avant et après délétion de F508. ... 51

Page | 7

Figure N°17 : Repliement coopératif et mise en place des domaines durant la biogénèse de la protéine

WT-CFTR et défauts mis en jeux lors de l‟assemblage de la protéine mutée F508del-CFTR. ... 53

Figure N°18 : Protéine mutée F508del-CFTR. ... 55

Figure N°19 : Impact de la mutation F508del-CFTR sur l‟activité du canal CFTR. ... 57

Figure N°20 : Principe de la thérapie génique appliqué à la mucoviscidose. ... 60

Figure N°21 : Illustration de la thérapie de substitution visant à pallier le défaut de conductance Cl- _lié à F508del-CFTR. ... 61

Figure N°22 : Potentialisation de l‟activité de WT-CFTR, F508del-CFTR et G551D-CFTR en présence de 10 µM VX770. ... 67

Figure N°23 : Localisation des mutations « second sites suppresseurs » sur la structure de F508del-CFTR. ... 71

Figure N°24 : Modèle de classification des correcteurs basé sur leurs mécanismes moléculaires... 72

Figure N°25 : Cinématique de correction de la mutation F508del-CFTR et ciblage pharmacologique. ... 79

Figure N°26 : Chronologie de mes travaux de recherche réalisés en parallèle du projet « fonction et modulateurs de fonction de CFTR ». ... 81

Figure N°27 : Cibles des différents correcteurs utilisés au cours de l‟étude. ... 83

Figure N°28 : Organigramme du consortium « fonctions et modulateurs de fonction de CFTR ». ... 85

Figure N°29 : Modèle d‟étude, conception et synthèse des SBC. ... 86

Figure N°30 : Réduction du sel de tétrazolium en formazan au sein des cellules métaboliquement active, réaction à la base du test MTT. ... 96

Figure N°31 : Illustration du principe du test MTT et exemple de résultats expérimentaux. ... 97

Figure N°32 : Illustration général du principe du western blot. ... 98

Figure N°33 : Exemple de quantification densitométrique de la protéine CFTR par la technique de western blot. ... 103

Figure N°34 : Tracés et images XY représentant l‟évolution de la fluorescence de la sonde oxonol en fonction du temps enregistrés dans des cellules HeLa WT-CFTR suite à l‟exposition à un cocktail d‟activateur (Fsk 10 µM + Gst 30 µM) et à un inhibiteur (CFTRinh172 10 µM). ... 106

Figure N°35 : Représentation graphique des efflux d‟iodure et analyse, mésurés dans des cellules HeLa WT-CFTR... 108

Figure N°36 : Schéma représentatif de la technique de « patch clamp » ainsi que ses différentes configurations. ... 110

Figure N°37 : Suivi électrique de la réalisation du seal et de l‟obtention de la configuration cellule entière. ... 112

Figure N°38 : Schéma d‟une partie du circuit électrique de la configuration cellule entière. ... 116

Figure N°39 : Dispositif expérimental nécessaire à la réalisation d‟expériences de patch clamp. ... 118

Figure N°40 : Protocoles de patch et réponses physiologiques enregistrées en configuration cellule entière. ... 122

Figure N°41 : Squelette de base des SBCs constitué d‟une molécule azotée hétérocyclique (noyau purine) présentant un cycle imidazole fusionné à un cycle pyrimidine... 142

Figure N°42 : Stratégie d‟évaluation GO/NO GO et sélection des composés SBCs « leaders ». ... 143

Figure N°43 : Illustration des quatre profils de viabilité cellulaire obtenus après incubation de différentes concentrations de SBCs. ... 144

Figure N°44 : Première étape d‟évaluation et de sélection des composés SBCs non toxiques, test MTT et stratégie GO/NO GO. ... 145

Figure N°45 : Evaluation de l‟efficacité de correction des SBCs sur cellules HeLa F508del-CFTR. 147 Figure N°46 : Evaluation de la restauration fonctionnelle d‟une activité F508del-CFTR suite au traitement par les SBCs et sélection des composés actifs (GO/NO GO). ... 149

Page | 8

Figure N°47 : Evaluation de l‟efficacité de correction des SBCs sur le profil de maturation des

cellules HeLa F508del-CFTR. ... 150

Figure N°48 : Evaluation de l‟effet d‟un traitement SBCs sur le profil de maturation de

F508del-CFTR, Western-Blot et stratégie GO/NO GO. ... 152

Figure N°49 : Illustration bilan de la stratégie de sélection GO/NO GO recoupant les trois techniques

utilisées, la technique de test MTT, d‟efflux d‟iodure et de Western-Blot sur cellules HeLa F508del-CFTR. ... 153

Figure N°50 : Evaluation de l‟efficacité de correction de composés SBCs « leaders » sur cellules

CFBE F508del-CFTR. ... 155

Figure N°51 : Evaluation de l‟efficacité de correction de trois composés « leaders » sur

F508del-CFTR. ... 156

Figure N°52 : Effet des SBC037, SBC040 et SBC069 sur le courant global F508del-CFTR enregistré

à 37°C. ... 157

Figure N°53 : Evaluation de la restauration d‟un courant F508del-CFTR après incubation de cellules

HeLa F508del-CFTR avec les composés SBC037, SBC040 et SBC069. ... 158

Figure N°54 : Effet du temps d‟incubation de SBC079 sur l‟efficacité de correction de

F508del-CFTR. ... 159

Figure N°55 : Persistance de la correction de F508del-CFTR par SBC079. ... 159 Figure N°56 : Validation des mutants « second sites suppresseurs » sur cellules BHK transfectées en

l‟absence ou présence de VX809. ... 163

Figure N°57 : Hypothèse d‟adressage de F508del-CFTR corrigée suite aux traitements SBCs. ... 168

Figure N°58 : Carte de restriction du plasmide pEGFP-C1. ... 171

Figure N°59 : Evaluation de l‟impact de différentes concentrations de SBCs sur la viabilité cellulaire.

... 179

Figure N°60 : Evaluation de l‟efficacité de correction des SBCs sur cellules HeLa F508del-CFTR. 181

Figure N°61 : Evaluation de la restauration du profil de maturation sur cellules HeLa F508del-CFTR

Page | 9

Liste des abréviations

A

aa acide aminé

ABC ATP -binding cassette

AC adénylate cyclase

ADN acide désoxyribonucléique

ADP adénosine diphosphate

AG appareil de Golgi ou Golgi

AMPc adénosine Monophosphate cyclique

ARNm acide ribonucléique messager

ATF6 activating transcription factor 6

ATP adénosine triphosphate

B

BCA bicinchonique acid

BHK baby hamster kidney

BSA bovine serum albumin

C

CAL CFTR associated ligand

CF cystic fibrosis

CFBE cystic fibrosis bronchial epithelial

CFF Cystic Fibrosis Fundation

CFTR cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator

CHIP C-terminus of Hsc70 interacting

protein

CHO Chinese hamster ovary

CNX calnexine

COP coat protein

C-term carboxy-terminale

D

DIDS acide 4, 4' -diisothiocyanatostilbène-

2, 2' –disulfonique

DMSO diméthylsulfoxyde

DMEM Dulbecco‟s modified eagle medium

E

ECL extra-Cellular Loop

EGF epidermal growth factor

EGFP enhanced green fluorescent protein

ENaC epithélial Na+ channel

ERAD endoplasmic reticulum associated

degradation

ERAF endoplasmic reticulum associated

Folding

ERQC endoplasmic reticulum quality

control

F

FDA food and drug administration

Fsk forskoline

FRT fisher rat thyroid

G

GFP green fluorescent protein

Glc glucose

GRASP Golgi reassembly stacking proteins

Gst génistéine

GTP guanosine triphosphate

H

hBE human bronchial epithelial cell

HDAC histone deacetylase

Hsp heat shock proteins

HSV herpes sumplex

HTS high throughput screening

I

IBI inter burst interval

ICL intra-cellular loop

IRE1 inositol-requiring protein 1

ISS in silico screening

M

Man mannose

MBD mean burst duration

MSD membrane spanning domain

MTS methanethiosulfonate

N

NBD nucleotide binding domain

NHERF Na+_/H+ _{Exchanger Regulatory Factor}

NKCC co-transporteur Na+_/K+_/Cl

-N-term amino-terminale

O

ORCC outwardly rectifying chloride

channel

P

PBS phosphate buffered saline

PCR polymerase chain reaction

PDE phosphodiestérase

PDZ postsynaptic density protein

Pgp P-glycoprotéine

PKA protéine kinase A

PKC protéine kinase C

PP phosphatases

PERK PKR-like ER localized elF2α kinase

P/S penicilline/streptomycine

Q

R

ROMK renal outer medullar K+

rpm rotation par minute

S

SAHA suberoylanilide hydroxamic acid

SBC structure based corrector

SCAM substituted cysteine accessibility

mutagenesis

SDS sodium dodecyl sulfate

sss mutations « second sites

suppresseurs »

STIM signalisation et transports ioniques

membranaires

SVF sérum de veau fœtal

T

TK thymidine kinase

Page | 10

U

UGGT uridine-di phosphate-glycoprotein

glucosyltransférase

UPR unfolded protein response

V

VEMS volume expiratoire maximum

seconde

VIP vasoactive intestinal peptide

VS virtual screening

W

Page | 11

Introduction

Cette partie introductive s‟organisera autour de trois grands axes. Tout d‟abord, nous développerons le rapport entre la mucoviscidose et la protéine CFTR. Nous focaliserons ensuite notre attention sur l‟une des mutations du gène la plus répandue à l‟origine de la forme grave de la maladie, F508del-CFTR, ainsi que ses conséquences structurales et fonctionnelles sur la protéine. En conclusion, nous aborderons une présentation générale des stratégies pharmacologiques développées afin de corriger les défauts liés à cette mutation

.

I.

De la mucoviscidose à la protéine CFTR

A. La mucoviscidose

1. Définition

La mucoviscidose, ou fibrose kystique selon la terminologie anglo-saxone (cystic fibrosis, CF), est la maladie génétique autosomale récessive et létale la plus répandue dans la population caucasienne, retrouvée principalement en Europe et Amérique du Nord. Le spectre de la pathologie est relativement vaste et concerne une naissance sur 2500, une personne sur 50 étant porteuse du gène muté.

Sur le plan moléculaire, la mucoviscidose est la conséquence de mutations du gène codant pour une protéine transmembranaire particulière, la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), littéralement traduit sous le nom de « régulateur des conductances transmembranaires dans la Mucoviscidose ». Avec cette pathologie, il convient d‟en éviter l‟un des écueils puisqu‟on ne parle pas de mucoviscidose mais des mucoviscidoses. En effet, à l‟heure actuelle il est recensé pas moins de 1900 mutations du gène CFTR dont les conséquences sont la production de protéines anormales (http://www.genet.sickkids.on.ca). La nature et la gravité de ces anomalies sont variables selon les mutations et le degré d‟impact de celles-ci sur la voie de biosynthèse et la fonctionnalité de la protéine CFTR (cf. II.A chapitre Introduction, p.45).

2. Historique

Les premiers rapports médicaux faisant état de la pathologie datent du moyen âge. À cette époque, l‟unique description reposait sur l‟association d‟une observation médicale qui rapportait que les enfants dont la peau laissait un goût salé avaient une espérance de vie limitée et de premiers rapports anatomiques qui montraient un pancréas anormal et fibreux. « Malheur à l'enfant chez qui un baiser sur le front a un goût salé. Il est ensorcelé et doit bientôt mourir». Cette citation peut paraitre un raccourci rapide mais elle relate finalement bien les phénomènes mis en jeu dans la mucoviscidose et

Page | 12 qui trouveront une explication physiopathologique quelques siècles plus tard. L‟absence de corrélation entre les multiples symptômes observés chez les malades a pendant de nombreuses années empêchée la mise en place d‟un diagnostic de la pathologie. Il faut attendre les années 1930 avant de voir apparaitre le terme de fibrose kystique et les années 1940 pour voir celui de « mucoviscidosis » (Farber., 1943). C‟est sous ce terme que pour la première fois la pathologie n‟est plus résumée à une simple atteinte pancréatique mais caractérisée comme étant responsable de sécrétions de mucus abondamment épais et visqueux. Aujourd‟hui, le terme « mucoviscidosis » a laissé la place à celui de « cystic fibrosis » au sein de la communauté internationale bien que certains chercheurs, et notamment francophones, restent très attachés à celui de mucoviscidose qui selon eux décrit de manière plus adéquat les phénomènes impliqués.

Historiquement, ce n‟est qu‟en 1946 qu‟Andersen et Hodges ont démontré pour la première fois que cette pathologie avait une origine génétique (Andersen et Hodges., 1946) et il s‟est écoulé 40 ans avant que le gène incriminé ne soit identifié, décrit et isolé (Kerem et al., 1989 ; Riordan et al., 1989).

3. Physiopathologie

La protéine CFTR est une protéine membranaire, présente à la membrane apicale des cellules épithéliales, qui contrôle les échanges d‟eau et de sels minéraux entre la cellule et son milieu externe luminal. Cette protéine joue un rôle physiologique fondamental dans la régulation des transports ioniques (notamment des ions chlorures et bicarbonates) de part et d‟autre de la membrane apicale. Dans un contexte physiopathologique, l‟imperméabilité des membranes suite à l‟apparition de mutations à l‟origine de l‟absence de production de protéine, la production d‟une protéine tronquée, ou encore la production d‟une protéine correctement adressée mais non fonctionnelle, entraine une dérégulation globale du transport des fluides et des électrolytes au sein des épithéliums. Cette dérégulation est responsable d‟une atteinte fonctionnelle de nombreux organes notamment du poumon, du pancréas, des intestins, du foie ainsi que des voies biliaires principales. Les conséquences structurales et fonctionnelles des mutations sur la protéine CFTR vont conditionner le degré de gravité de la pathologie qui dans sa forme la plus grave concerne à la fois le système respiratoire et digestif. Certaines mutations, du fait de leur localisation dans la séquence codante du gène sont plus silencieuses et ne provoquent pas d‟atteinte respiratoire, d‟autres ne touchent pas la sphère digestive.

Afin de simplifier au mieux le tableau clinique de la mucoviscidose, il existe deux causes principales de décès chez les patients CF atteints de formes sévères de la pathologie. Premièrement, une obstruction chronique des voies aériennes, causée par un épaississement du mucus et sa stagnation qui empêche une clairance mucociliaire et un battement ciliaire physiologique. Deuxièmement, l‟installation d‟une infection bactérienne persistante par des micro-organismes opportunistes,

Page | 13 typiquement à Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, ainsi qu‟une réponse inflammatoire qui est à l‟origine de lésions irréversibles et de défaillances respiratoires (Figure N°1)1

(Welsh et Smith., 1993).

D‟un point de vue thérapeutique, les progrès médicaux réalisés depuis quelques années dans le traitement et la prise en charge de cette pathologie ont fait évoluer l'espérance de vie des patients atteints. Cependant, à l‟heure actuelle, on ne dispose pas de traitement curatif permettant de ralentir de manière efficace et durable la destruction des tissus, notamment pulmonaires et pancréatiques.

Figure N°1 : Physiopathologie de la mucoviscidose, du gène aux atteintes physiologiques. (Source : Le Figaro.fr, article du 01.05.2011 intitulé « des progrès contre la mucoviscidose »)

B. Du gène à la biosynthèse de la protéine CFTR

1. Le gène

En 1989 fut identifié un gène (nommé CFTR) dans la région de l‟ADN (acide désoxyribonucléique) du chromosome 7 et qui code pour une protéine dont on ne connait pas encore, à l‟époque, le rôle mais qui semble associée à la mucoviscidose (Kerem et al., 1989 ; Riordan et al., 1989) (Figure N°2). Ce gène est précisément localisé sur le locus 7q31.1 du bras long du chromosome 7, mesure 250 kb et comprend 27 exons. Il faudra attendre 1991 pour que Michael.J. Welsh et son équipe mettent en évidence son rôle de canal chlorure ou de régulateur de canal chlorure de la protéine

1 _{Au même titre que « l‟œuf et la poule », le débat est toujours ouvert sur la relation de cause à effet entre}

Page | 14 CFTR (Anderson et al., 1991) et une étude de « single2 _{» menée par le groupe de John.W. Hanrahan}

qui apporte la preuve selon laquelle la protéine produite à partir du gène CFTR est responsable d‟une conductance chlorure régulée par phosphorylation/déphosphorylation de la protéine (Tabcharani et

al., 1991).

Figure N°2 : CFTR, du gène à la protéine.

(Figure adaptée de Girodon-Boulandet et Costa., 2005).

2. La protéine

a. CFTR, un membre de la famille des transporteurs ABC

CFTR est une protéine de transport membranaire composée de 1480 acides aminés et membre de la famille des transporteurs ABC (ATP (adénosine triphosphate)-binding cassette) (Dean et al., 2001 ; Rees et al., 2009). Cette famille de transporteurs englobe 49 gènes chez l‟homme divisés en 7 sous familles (ABCA-ABCG) (Dean et al., 2001). CFTR est l‟un des 13 membres de la sous famille ABCC (ABCC7 selon cette nomenclature (Higgins et Linton., 2004)), dans laquelle de nombreux membres fonctionnent comme des exporteurs de diverses substances organiques médiés par l‟ATP.

CFTR est l‟unique membre à ne pas fonctionner comme un transporteur actif mais comme un canal chlorure régulé, et dont la fonction dépend de la fixation et de l‟hydrolyse de l‟ATP. Pour la majorité des transporteurs ABC, le mécanisme de transport est actif, induit par l‟énergie libérée par

2 _{Le terme de « single » est communément employé pour qualifier des expériences de patch-clamp en}

configuration membrane attachée ou membrane excisée (cf. III.C.4.a et III.C.4.c chapitre Matériel et

Méthodes, p.115). Ce type d‟expériences permet notamment l‟accès aux phénomènes d‟ouverture/fermeture, à leur cinétique ainsi qu‟à l‟ensemble des paramètres biophysiques du canal.

Chromosome 7

Transcription épissage

Traduction

Protéine CFTR de 1480 aa, 2 domaines de 6 hélices alpha insérées dans la membrane et 3

domaines cytoplasmiques

NBD1

Page | 15 l‟hydrolyse de l‟ATP. Cette énergie est alors utilisée comme moteur de transport unidirectionnel de substrats au travers des membranes, potentiellement contre le gradient de concentration. Par contraste à ce mécanisme de transport relativement conservé, CFTR apparait comme l‟unique exception pour laquelle sa fonction de canal ionique est médiée par le transport passif et le mouvement d‟électrodiffusion des ions chlorures, bicarbonates et autres petits anions au travers la membrane cellulaire (Liu et al., 2003 ; Lindsdell., 2006 ; Hwang et Kirk., 2013).

Il apparait probable qu‟à différents stades de l‟évolution, CFTR ait dérivé fonctionnellement (Chen et Hwang., 2008 ; Jordan et al., 2008) et structurellement (Rishishwar et al., 2012 ; Hunt et

al., 2013 ; Sebastian et al., 2013) de cette sous famille ABCC mais que ses fonctions aient évolué

d‟un transport actif à un transport passif via une activité d‟électrodiffusion ionique. Ce rapport à l‟évolution des transports actifs a parfois valu à CFTR l‟étiquette péjorative de « pompe cassée » (Mornon et al., 2009 ; Miller., 2010).

b. Structure

La description de la structure de CFTR repose sur des analogies structurales et des comparaisons de séquences entre CFTR et des membres de la famille des transporteurs ABC (Figure N°3). Ces comparaisons concernent par exemple des membres tels que la perméase periplasmique prokaryote, les systèmes de transport de l‟histidine et du maltose, ou encore la P-glycoprotéine (Pgp).

Figure N°3 : Exemple type d’une étude de recherche d’homologies par analyse de séquences (ici les régions de TM2 et 8 et ICL 1 et 3) entre différents transporteurs ABC (notés sur la gauche de la figure) (Figure adaptée de Mornon et al., 2014).

Sa structure présente une architecture « minimale » commune aux autres membres avec deux motifs ou domaines transmembranaires MSD1 et MSD2 (membrane spanning domain) composés chacun de 6 segments transmembranaires, TM1 à TM6 (transmembrane domain) pour MSD1 et TM7 à TM12 pour MSD2 organisés en hélice α. Chacun de ces segments est relié l‟un à l‟autre et aux

Page | 16 domaines cytoplasmiques de fixation des nucléotides (respectivement NBD1 (nucleotide binding domain 1) pour MSD1 et NBD2 pour MSD2) par des boucles intracellulaires et extracellulaires. A la différence des autres transporteurs ABC et cela uniquement dans le cas de CFTR, NBD1 est connecté à une structure désordonnée, le domaine de régulation (domaine R), qui joue un rôle important dans la régulation de l‟accessibilité des NBDs aux molécules d‟ATP. Ce domaine contient des sites multiples de phosphorylation (sites consensus) ainsi que de nombreux acides aminés chargés et requiert une étape de phosphorylation par les protéines kinases PKA (protéine kinase dépendant de l‟adénosine monophosphate cyclique (AMPc)) et PKC (protéine kinase C) pour permettre l‟ouverture du canal (Gadsby et al., 1999).

Alors que les connaissances actuelles de la structure de CFTR progressent, nous pouvons commencer à comprendre le rôle de chacun des domaines et comment ils déterminent la fonction complète du canal.

3. Des différents domaines à la fonction de CFTR

La topologie générale de CFTR a été investiguée par différentes approches utilisant entre autres des anticorps sur cellules perméabilisées ou non (Riordan et al., 1989). L‟objectif était de déterminer le profil d‟hydrophobicité de la protéine et assigner à chaque domaine un emplacement relatif par rapport à la membrane cellulaire. Ces études ont entre autre permis d‟assigner le domaine R et l‟extrémité carboxyl terminale à la face intracellulaire ou encore placer les sites de glycosylation à la face extracellulaire entre TM7 et TM8 (Figure N°4). Des études fonctionnelles ont ensuite complété le travail et notamment suggérées que le domaine R et les NBDs étaient localisés au niveau de la face intracellulaire de la membrane (Figure N°4). Une fois la topologie générale exposée, des expériences de mutagénèse dirigée et de SCAM3 _{(substituted cysteine accessibility mutagenesis) sont utilisées dans}

le but de mettre en évidence la participation de certains acides aminés dans la formation du pore, la fonction du canal ou encore son activité et sa régulation.

3 _{La technique de SCAM est une technique extrêmement puissante, qui combine mutagénèse dirigée et propriété}

biochimique d‟agents réactifs de la cystéine, et permet d‟obtenir des éléments de réponse concernant la structure ou la fonction des protéines. Par mutagénèse dirigée, les acides aminés (aa) des régions d‟intérêt (le plus souvent ces aa sont suspectés pour leur participation à des sites de fixation ou la paroi d‟un pore) sont mutés un à un en cystéine. Leur réactivité à un composé MTS (Methanethiosulfonate) est ensuite testée. S‟il y a réaction entre les cystéines et l‟agent réactif, cela signifie que les aa sont accessibles et leur position relative localisée en contact du milieu dans lequel ont été placés les composés MTS (application à la face extra- ou intracellulaire).