A. Contexte scientifique et objectifs
Ce premier axe de recherche s‟appuie sur l‟étude des effets de la combinaison de différentes molécules correctrices pour restaurer la maturation protéique et la fonctionnalité de la protéine mutée avec l‟objectif de se rapprocher du profil de la protéine sauvage.
En effet, depuis les années 1995-2000, des petites molécules appelées « correcteurs » ont été identifiées et développées pour leur capacité à restaurer individuellement l‟adressage de la protéine mutée ainsi que sa fonctionnalité à la membrane. Cependant, ces travaux montrent aussi que toutes ces molécules correctrices ne le sont que partiellement et ne permettent, dans le meilleur des cas, que d‟atteindre un niveau de restauration fonctionnelle évalué à une dizaine de % du niveau de fonctionnalité de la protéine sauvage. La présence de multiples défauts de la protéine CFTR causés par la mutation F508del ainsi que la mise en place des mécanismes de contrôle qualité, suggèrent que l‟utilisation de systèmes de corrections multiples soit nécessaire. Au cours de récentes études et notamment celles combinant le VX809 et VX770 (Phuan et al., 2014), plusieurs molécules agissant sur différentes cibles de la voie de biosynthèse ou directement sur la protéine F508del-CFTR, pourraient présenter des effets cumulatifs et ainsi augmenter le niveau de restauration de la fonction de canal chlorure de la protéine F508del-CFTR. De telles conclusions sont cependant à modérer puisqu‟une étude vient tout juste de démontrer qu‟en association chronique dans des cellules épithéliales CF, le VX770 abrogeait l‟effet correcteur du VX809 sur la mutation (Cholon et al., 2014). Au regard de ces résultats, l‟une des autres questions importantes qu‟il conviendra de se poser à l‟avenir, outre les questions de combinaison, est à partir de quel moment peut-on considérer qu‟une molécule montrant des effets correcteurs dans des cellules CF peut apporter un réel bénéfice au patient sur le plan clinique ? Cette question est notamment soulevée par un composé tel que le VX809 qui montre une restauration cellulaire de l‟activité de F508del-CFTR mais dont le bénéfice clinique est faible (Clancy et al., 2012).
Des travaux précédents, dont plusieurs ont été menés par notre équipe, ont identifié des molécules capables de corriger individuellement les défauts liés à la mutation F508del-CFTR. C‟est le cas
Page | 83 notamment des molécules suivantes : les fixateurs de F508del-CFTR ; VX809 (Van Goor et al., 2011 ; Loo et al., 2013) et Corr4a (Pedemonte et al., 2005b), ainsi que les modulateurs protéostasiques SAHA (Hutt et al., 2010), IsoLAB (Ardes-Guisot et al., 2011 ; Best et al., 2011) Miglustat (Norez et al., 2006), Roscovitine (Norez et al., 2014).
Le but de ce premier axe de recherche est de déterminer, à partir de combinaisons de ces molécules en association avec les potentiateurs, VX770 (Van Goor et al., 2009 ; Accurso et al., 2010) ou la génistéine (Illek et al., 1995 ; French et al., 1997), s‟il est possible, en agissant sur différents leviers de la voie de biosynthèse (Figure N°27), de cumuler les effets correcteurs. Si oui, comment déterminer les conditions optimales de combinaison qui conduiraient à une restauration fonctionnelle pharmacologique d‟une activité F508del-CFTR la plus proche possible d‟une situation non pathologique.
Figure N°27 : Cibles des différents correcteurs utilisés au cours de l’étude. (en rouge sur la figure, figure adaptée de Boinot et al., 2014).
RE G
N
Cl-
Voie de biosynthèse : Chaperonnes moléculaires & enzymes
F508del-CFTR F508del-CFTR corrigé M em br ane pl as m ique Correcteurs de classe C2 Correcteurs de classe C1 Correcteurs de classe C4 = Modulateurs protéostasiques Cibles : NBD1-ICL1; NBD1-ICL4 e.g. VX809 Cible F508del-NBD2 e.g; Corr4a
e.g. iminosucres, SAHA, sildenafil/vardenafil, 4-PBA…
Classe C5, Potentiateurs = Fixateurs de CFTR
e.g. Kalydeco (VX770); génisteine Chaperonnes pharmacologiques = Fixateurs de CFTR
Correcteurs de classe C3 Cible F508del-NBD1 e.g. NS407882; NS7311;
NS118208; RDR1
Modulateurs/inhibiteurs d‟enzymes (glucosidases, PDE-5…) Inhibiteurs de chaperonne moléculaire (HSP-70; HSP-90…)
HDAC et inhibiteurs du proteasome
Cl-
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B. Notre schéma expérimental
L‟ensemble des investigations a été réalisé sur des cellules épithéliales de carcinomes humains, HeLa, stablement transfectées (WT-CFTR ou F508del-CFTR). Afin de rendre compte de l‟intérêt ou non de certaines combinaisons de molécules sur la correction, trois paramètres ont été étudiés :
- la toxicité cellulaire, évaluée par quantification des cellules vivantes (test MTT) dans chacune des conditions appliquées que ce soit en présence des correcteurs utilisés individuellement ou en combinaison.
- la maturation protéique, déterminée par la technique de Western-Blot et la quantification du rapport (bande C/(bande B + bande C). Ce rapport permet de mesurer le niveau de restauration de la maturation de la protéine mutée.
- la fonctionnalité de F508del-CFTR, évaluée par la technique de patch-clamp en configuration cellule-entière en réponse à un cocktail d‟activateurs (forskoline 10 µM + génistéine 30 µM ou VX770 10 µM) ± l‟inhibiteur sélectif de CFTR, le composé CFTRinh-172 à 10 µM.
Des études de stabilités thermiques à 37°C ont également été menées par la technique de patch- clamp en configuration cellule entière suite à une activation forskoline + génistéine (Fsk + Gst) afin d‟évaluer l‟impact de combinaisons sur la perte d‟activité de F508del-CFTR à 37°C, comme observé récemment (Wang et al., 2011).
II.
Axe 2 : Evaluation et validation de nouveaux modulateurs de
F508del-CFTR
A. Contexte scientifique et objectifs
Ces travaux ont pour but d‟identifier et de développer de nouvelles molécules capables de corriger les défauts d‟adressage et de fonctionnalité de F508del-CFTR.
Comme nous venons de le voir, depuis plusieurs années, des efforts importants ont été consacrés au développement de molécules ciblant les défauts de la protéine CFTR. Des études HTS (High Throughput Screening) ont permis de conduire à l‟identification d‟activateurs et correcteurs de CFTR et de ses mutants, dont l‟exemple le plus marquant, le Kalydeco (activateur spécifique d‟une mutation de classe 3, G551D), a récemment démontré son efficacité clinique et ouvert la voie au développement d‟une pharmacologie de la mucoviscidose. Le développement de correcteurs de F508del-CFTR apparaît cependant plus délicat, vraisemblablement en raison du fait que la correction doit probablement cibler plusieurs sites différents de la protéine (stabilité de NBD1, interface NBD1/ICL4 notamment) et impliquer plusieurs correcteurs.
Page | 85 En parallèle des études de HTS, des approches alternatives dites d‟« In Silico Screening » (ISS) se mettent progressivement en place afin de définir des cibles moléculaires spécifiques de F508del- CFTR, en particulier de correcteurs, à partir de la connaissance des caractéristiques structurales de la protéine. Des premiers travaux ont été réalisés, en utilisant les structures 3D (modèles ou structures expérimentales) pour cribler virtuellement des banques, à la recherche de molécules déjà décrites et capables de se loger dans des cavités en surface des protéines, ou à l‟interface entre leurs domaines. Ainsi, Kalid et ses collaborateurs ont utilisé un modèle de l‟assemblage MSD:NBD pour cribler une banque privée (EPIX), alors que Odolczyk et ses collaborateurs ont considéré une structure expérimentale isolée de F508del-CFTR-NBD1 pour cribler une banque publique (NCIDS) (Kalid et
al., 2010 ; Odolczyk et al., 2013). Ces études, en isolant des molécules permettant la restauration
partielle d‟une activité F508del-CFTR à la surface membranaire des cellules, apportent la preuve de concept qu‟il est possible d‟utiliser les informations structurales in silico, afin de guider le choix de molécules a priori spécifiques de la cible. Pour aller plus loin dans cette démarche structurale, des études ont également été entreprises afin de concevoir in situ de nouvelles molécules, non encore décrites, s‟adaptant spécifiquement aux caractéristiques du modèle de structure 3D de la protéine F508del-CFTR. La spécificité des molécules ainsi construites peut être alors validée plus finement par des études d‟amarrage moléculaire.
Mon second axe de recherche s‟inscrit dans cette deuxième démarche structurale et participe à un projet pluridisciplinaire (physique-chimie-biologie) alliant l‟expérience de trois équipes complémentaires (Figure N°28).
Figure N°28 : Organigramme du consortium « fonctions et modulateurs de fonction de CFTR ».
Modélisation moléculaire
Tests Biologiques
Synthèse chimique
Modèles : canal ouvert (Sav1866, 2008) canal fermé (MsbA, 2009) (JP Mornon, P Lehn, I Callebaut)
• Construction ab-modélo de correcteurs potentiels de poche F508del
(JP Mornon, JL Decout)
Points « chauds » fonctionnels
Synthèse de correcteurs potentiels de poche F508del
(B Boucherle, R Haudecoeur, JL Decout)
Amarrage moléculaire (validation, criblage)
(B Hoffmann, A Fortuné)
Correcteurs potentiels
Synthèse de nouveaux correcteurs potentiels Nouveaux modèles / modèles affinés
(JP Mornon, B Hoffmann, P Lehn, I Callebaut)
Mutagénèse dirigée Etude maturation Etude fonctionnelle
(efflux iodure, patch-clamp, …)
(C Boinot, C Norez, M Jollivet, F Becq)
Equipe
TIM
Transports Ioniques et Mucoviscidose
Page | 86 La construction de modèles de structure 3D de la protéine CFTR sauvage et F508del-CFTR, réalisée au sein de l‟équipe « Modélisation moléculaire » du consortium, a permis de mettre en évidence un site d‟intérêt (appelé cavité F508del-CFTR) pour la conception de composés actifs et en particulier de correcteurs (Figure N°29, A). Nous sommes partis du principe qu‟en développant des petites molécules capables de combler cette cavité, il pourrait être possible de restaurer un profil structural proche du profil « sauvage » de CFTR et ainsi pallier les éventuels défauts de repliement inhérents à F508del-CFTR.
Dans ce but, des correcteurs potentiels nommés SBC (structure based corrector), conçus in situ à partir des modèles développés et validés par l‟intermédiaire d‟expériences d‟amarrage moléculaire, ont été synthétisés par l‟équipe « Synthèse chimique » de notre consortium (Figure N°29, B). Dans un souci de confidentialité lié aux aspects de valorisation, les structures chimiques, de même que les caractéristiques topographiques de la cavité F508del-CFTR qui a servi de « moule » à la conception, ne seront pas présentées dans ce manuscrit, un brevet étant en cours de rédaction.
Figure N°29 : Modèle d’étude, conception et synthèse des SBC.
(A) Cavité présente à la surface du modèle de structure 3D de la protéine F508del, à l’interface des domaines NBD1 (en bleu) et MSD2 (ICL4, en rouge), dans laquelle une molécule commerciale a été amarrée (B) Schéma de synthèse des composés conçus in silico, à partir de l’examen du modèle de F508del-CFTR.
Ce n‟est qu‟une fois cette étape de synthèse réalisée que mon travail intervient. Il s‟agit en effet d‟évaluer, via un ensemble de tests fonctionnels, l‟activité pharmacologique éventuellement correctrice sur F508del-CFTR de ces petites molécules. En parallèle nous avons développé des mutations artificielles, additionnelles à F508del-CFTR, afin de valider les prédictions et apporter la preuve indirecte de la fixation des SBCs dans la cavité ciblée.
R1 R2 R3 H X Y R1 X Y Etape 1 R1 R 2 Y Etape 2 Etape 3 1 2a, 2b 3a 4 Composés de la famille B Composés de la famille A A B
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