Le complexe de pré intégration PIC est un complexe nucléoprotéique composé de l’intasome mais également de différentes protéines de nature cellulaire et virale. Il a été démontré que le PIC contient les protéines virales de structure matrice (MA) et nucléocapside (NC), la protéine accessoire Vpr, ainsi que l’enzyme virale transcriptase inverse (RT). L’implication et le rôle de la capside (CA) dans le PIC est encore un sujet soumis à controverse.
Comme décrit précédemment le rôle des protéines de structure dans ce complexe semble principalement être associé à l’import nucléaire du PIC afin que l’ADN viral puisse être intégré dans le génome cellulaire.
65 L’interaction IN-RT semble jouer un rôle dans l’étape de transcription inverse car la mutation indépendante de chacun des trois domaines de l’IN induit un défaut de transcription inverse [225,226,227]. Cependant le rôle de cette interaction n’est pas encore clairement défini car des études contradictoires montrent que la RT inhibe l’activité catalytique de l’IN [228] ou que l’IN inhibe l’activité de la RT [229] alors que d’autres montrent que la RT est capable de stimuler la réaction de transfert de brin in vitro médiée par l’IN [230] et que l’IN augmente l’initiation de la transcription inverse [227].
La NC est un cofacteur de l’intégration in vitro [231] et il a été rapporté que des mutants de la NC entrainaient une inhibition au niveau des étapes de transcription inverse et d’intégration dans des cellules infectées [20].
b) Les cofacteurs cellulaires
Le VIH-1 est capable de tirer avantage de la machinerie cellulaire afin de réaliser différentes étapes de son cycle de réplication y compris pour l’intégration. En effet, bien que la protéine IN recombinante purifiée est nécessaire et suffisante pour induire les réactions de 3’ processing et de transfert de brin in vitro, l’implication de partenaires viraux et cellulaires est essentielle pour l’intégration du provirus dans des cellules infectées.
Contrairement à ce qui est observé avec l’IN recombinante seule, le complexe PIC purifié permet l’insertion des extrémités de l’ADN viral de manière concertée dans le génome de l’hôte en diminuant le phénomène d’auto-intégration [232].
Des tests in vitro de l’activité catalytique du PIC [233,234], de crible en double hybride chez la levure [235,236] et de co-immunoprécipitation [211,237] ont été réalisés afin d’identifier les cofacteurs cellulaires de l’intégration rétrovirale.
Le principal cofacteur de la protéine virale IN est la protéine cellulaire LEDGF/p75 (Lens Epithelium-Derived Growth Factor) liée à la chromatine. Cette interaction IN-LEDGF étant la cible des inhibiteurs de l’intégrase en cours de développement sur lesquels sont basés mes travaux de thèse, la protéine LEDGF ainsi que son interaction avec l’IN seront détaillés dans la partie suivante de mon manuscrit.
Plusieurs autres cofacteurs putatifs de l’intégration ont pu être mis en évidence dont les protéines cellulaires HMGA1 et BAF identifiées comme interagissant avec l’ADN viral. En ce qui concerne les cofacteurs de l’IN, d’autres protéines ont été identifiées comme capables d’interagir de manière directe avec l’IN comme INI1, VBP1 et TNPO3 mais avec une affinité
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beaucoup plus faible que ce qui est observé pour l’interaction IN-LEDGF. Cependant le rôle de ces cofacteurs dans l’intégration et leur mécanisme d’action restent encore mal définis. HMGA1 (high mobility group protein 1A) est une protéine associée à la chromatine identifiée comme premier cofacteur cellulaire du PIC [233]. Il s’agit d’une protéine non-histone liant l’ADN dans des régions riches en AT, biologiquement impliquée dans l’activation de la transcription et dans la structure de la chromatine [238]. Les membres de la famille des HMGA possèdent la capacité de fixation à la fois aux protéines et à l’ADN. Dans un contexte infectieux, malgré le fait que HMGA1 n’interagisse pas de manière directe avec l’IN [239] cette protéine cellulaire stimule l’intégration in vitro [231]. Le rôle de HMGA1 dans l’intégration n’a pas été entièrement caractérisé mails il semblerait qu’elle agisse en interagissant et en stabilisant les deux extrémités maturées de l’ADN viral dans l’intasome [240]. Les sites potentiels de liaison avec HMGA1 ont été identifiés sur le LTR 5’ viral et correspondent aux sites de fixation de l’activateur transcriptionnel AP-1 (activating protein-1) [241]. Des études suggèrent que la liaison du cofacteur HMGA1 à l’ADN viral joue un rôle dans l’activation transcriptionnelle de l’ADN viral en augmentant la fixation d’un autre activateur de transcription ATF-3 associé au recrutement du complexe du remodelage de la chromatine hSWI/SNF [242,243].
Comme son nom l’indique, la protéine cellulaire BAF (barrier-to-autointegration factor) a été à l’origine identifiée comme un composant du PIC du rétrovirus MoMLV (Moloney murine leukemia virus) jouant un rôle dans la diminution du phénomène d’auto-intégration [234]. Plus tard, des expériences de co-immunoprécipitation ont mis en évidence cette activité dans l’intégration du VIH-1 [237]. BAF est une protéine cellulaire liant l’ADN très conservée qui possède un rôle physiologique structural nucléaire. Sa capacité de fixation à la fois à l’ADN mais aussi aux protéines nucléaires comme LAP-2α (lamina-associated polypeptide) suggère que BAF puisse faire le lien entre la membrane interne et la lamina nucléaires [244,245]. Bien que la stimulation de l’intégration in vitro par BAF ait été démontrée, l’implication potentielle du complexe LAP-2α/BAF/ADN viral dans la réplication du VIH-1 reste à définir. Le rôle de la protéine BAF dans la prévention de l’auto-intégration pourrait être corrélé à sa capacité à maintenir l’ADN viral maturé de façon compacte. Au vue de son aptitude à lier l’ADN, BAF pourrait également jouer un rôle dans l’association de l’ADN viral et cellulaire [246]. D’autres études ont mis en évidence la présence de dimères de BAF incorporés dans les virions VIH-1. De plus BAF semble capable de se lier à la MA sur le précurseur polypeptidique dans les particules virales [247].
INI1, (intégrase interactor 1) a été le premier partenaire cellulaire d’interaction de l’IN à être découvert par Kalpana & coll par crible double hybride dans le laboratoire de Steve Goff
67 [235]. La protéine INI1, homologue de SNF5 chez la levure, fait partie du complexe humain de réparation de la chromatine hSWI/SNF [248]. INI1 est capable de stimuler l’intégration in vitro mais ce phénomène n’a pas été observé à proprement dit in vivo. Au contraire, certaines études montrent que INI1 inhibe les étapes précoces de la réplication du VIH-1 [249]. Cependant au sein du complexe hSWI/SNF l’action d’INI1 est vraisemblablement modulée par l’accessibilité aux sites d’interaction sur l’ADN cellulaire et peut ainsi induire une inhibition ou une stimulation de l’intégration [250,251]. Ce complexe est également impliqué dans le ciblage dans des régions de chromatine remodelée de l’intégration [251]. D’autres fonctions d’INI1 sur la réplication du VIH-1 ont été proposées, comme l’implication d’INI1 dans l’acheminement et/ou le passage nucléaire du PIC suite au recrutement cytoplasmique d’INI1 précocement après l’infection. De plus INI1 présent dans les virions semble capable d’interagir avec la protéine IN dans le précurseur polypeptidique ce qui suppose un rôle supplémentaire d’INI1 dans les étapes tardives de l’infection [252].
Une autre protéine virale nommée VBP1 (von Hippel–Lindau binding protein 1) qui est une sous unité du complexe prefoldin chaperone a été identifiée par Mousnier et al. comme capable d’interagir avec l’IN VIH-1 [169]. Dans un contexte infectieux, VBP1 fait le lien entre l’IN et l’ubiquitine ligase cellulaire cullin2 (Cul2)-based von Hippel-Lindau (VHL). VBP1 et Cul2 sont requises pour une réplication du VIH-1 optimale et semblent jouer un rôle dans une étape entre l'intégration et la transcription des gènes viraux. VBP1 et Cul2 sont nécessaires à la polyubiquitylation efficace de l’IN entrainant ainsi sa dégradation par la protéasome. VBP1 semble également jouer un rôle dans un étape du cycle de réplication postérieure à l’intégration, au niveau de la transcription du génome viral.
Un crible double hybride a permis d’identifier la transportin-SR2 (TRN-SR2, TNPO3) comme un partenaire d’interaction caryophile de l’IN [253]. TRN-SR1 and TNPO3 permettent le transport entre le noyau et le cytoplasme des protéines SR (serine/arginine-rich proteins) qui jouent un rôle dans la régulation de l’épissage de l’ARNm [254,255]. TRN-SR1 and TNPO3 sont codés par un seul même gène (tnpo3) et leur expression dépend d’un épissage alternatif. Dans la plupart des lignées cellulaires analysées seul la protéine TNPO3 est exprimée alors que l’isoforme TRN-SR1 est indétectable [256]. Dans un contexte infectieux, TNPO3 semble jouer un rôle dans l’import nucléaire du PIC et également faciliter l’infection par le VIH-1. Les différents lentivirus possèdent des niveaux différents de dépendance au facteur cellulaire TNPO3 [257] et l’étape du cycle de la réplication du VIH-1 dans laquelle TNPO3 joue un rôle prédominent est encore un sujet très débattu. Par exemple, il a été suggéré que TNPO3 est impliqué dans une étape en amont de l’import nucléaire [258] ou lors de l’intégration et des étapes tardives de la réplication [83,85,259]. Une étude récente a permis de mettre en évidence que l’interaction entre la protéine cellulaire CPSF6 et la CA
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semble être un mécanisme alternatif de ciblage de l’intégration dans des régions transcriptionnellement actives [162]. Sachant que TNPO3 interagit directement avec CPSF6 et l’importe ou la maintient dans le noyau, ce mécanisme pourrait explique pourquoi CA, CPSF6 et TNPO3 semblent influencer le ciblage de l’intégration.
D’autres protéines cellulaires ont été identifiées comme capable d’interagir avec l’IN mais des expérimentations supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer d’une part si cette interaction est directe et d’autre part leur rôle sur la réplication du VIH-1. En effet, ces interactions avec l’IN pourraient être indirecte et médiées par exemple par le complexe PIC, d’autres protéines virales ou cellulaires ou encore par l’ARN viral. C’est le cas de la protéine nucléaire EED (embryonic ectoderm development protein) de la famille des protéines PcG (Polycomb group). Ces protéines sont impliquées dans la répression transcriptionnelle des gènes cellulaires via la désacétylation des histones. EED étant capable d’interagir avec l’histone désacétylase et le facteur de transcription YY1, son interaction avec l’IN pourrait avoir un rôle dans le ciblage de l’integration dans des régions actives du génome de l’hôte [260]. Une interaction entre l’IN et la protéine chaperonne HSP60 (heat shock protein 60) a également été mise en évidence [261]. HSP60 forme un complexe avec HSP10 permettant le repliement fonctionnel de manière ATP-dépendante des protéines « misfolded ». Cette interaction pourrait donc avoir un rôle dans la stabilisation de l’IN. Enfin une interaction de l’IN avec la protéine acétyltransferase p300 a également été rapportée [262]. Physiologiquement p300 interagit avec les histones acétylées et régule la conformation de la chromatine cellulaire, cette interaction IN-p300 pourrait donc moduler l’étape d’intégration du VIH-1.