Les protéines habituellement impliquées dans la recombinaison homologue 46

dans le cadre de la transformation génétique ne sont pas encore complètement élucidées. Le modèle général proposé est que l’ADNdb chromosomique est ouvert puis « envahi » par l’ADNsb donneur. Cet ADNsb s’apparie alors avec une séquence homologue ce qui provoque le déplacement d’un des brins chromosomiques et la formation d’une structure à 3 brins appelée D-loop. La résolution de cette structure passe par l’élimination du brin déplacé ce qui permet la formation d’un hétéroduplex. Celui-ci doit être résolu pour former ce que l’on appelle un transformant.

A.4.2.2.1. Les protéines habituellement impliquées dans la recombinaison homologue

RecA est la protéine ubiquitaire de la recombinaison. La plupart de nos connaissances sur le fonctionnement des RecA provient d’études effectuées avec la protéine RecA d’E. coli. Différents travaux ont permis de montrer que cette protéine est capable de catalyser les étapes centrales de la recombinaison telles que la recherche d’homologie, l’appariement de deux ADN et l’échange de brins (pour revue voir (Kowalczykowski et al. 1994) ; (Kowalczykowski 2000) ; (Cox 2007)). RecA est capable de polymériser rapidement de 5’ vers 3’, en se fixant de manière non spécifique sur de l’ADNsb libre ou causé par des ouvertures dans un ADNdb (Register & Griffith 1985). La purification de la protéine RecA de

S. pneumoniae et sa caractérisation biochimique ont permis de montrer qu’elle présente de

nombreuses propriétés communes avec RecA d’E. coli : elle a une activité ATPase ADNsb- dépendante, elle peut catalyser l’échange de brin de manière ATP-dépendante et elle est aussi capable de faciliter le clivage du répresseur du système SOS LexA d’E. coli (bien qu’aucun

47 homologue de LexA n’existe chez S. pneumoniae) (Steffen & Bryant 2000). En revanche, il a été montré in vitro que l’activité ATPase ADNsb-dépendante de RecA de S. pneumoniae est complètement inhibée par la présence de SsbA, alors que, pour RecA d’E. coli, cette activité est inhibée si SSB est introduite dans la réaction avant RecA et, au contraire, activée quand SSB est ajoutée après (voir plus loin pour plus de détails sur le rôle des SSB) (Steffen, Katz, & Bryant 2002).

Chez S. pneumoniae, un mutant du gène recA est extrêmement sensible aux U.V. et aux traitements chimiques endommageant l’ADN (Martin et al., 1995). Ce qui suggère que cette protéine est impliquée dans la réparation des dommages à l’ADN, et ce, par la recombinaison homologue. Le gène recA est exprimé de façon constitutive et est aussi un gène tardif de compétence. L’absence d’induction de la transcription de ce gène lors de la compétence provoque une diminution de la quantité de protéine d’un facteur 2 à 3 mais un déficit de transformation important (d’un facteur ~20) (Mortier-Barrière et al. 1998). En fait, dans une souche où RecA n’est pas induite lors de la compétence, on peut observer une forte diminution de la stabilité de l’ADNsb internalisé, cela permet de proposer l’hypothèse qu’une grande quantité de protéine RecA serait nécessaire à la protection de l’ADN internalisé et qu’une petite quantité seulement permettrait une recombinaison efficace (Isabelle Mortier- Barrière, communication personnelle).

D’autres protéines interviennent généralement dans la recombinaison homologue. Les SSB ont un rôle positif ou négatif sur le chargement de RecA sur l’ADNsb selon qu’elles sont présentes respectivement après ou avant RecA sur cet ADNsb (Kowalczykowski 2000). Dans le premier cas, les SSB favorisent la polymérisation de RecA en supprimant les structures secondaires de l’ADNsb (Roy et al. 2009). Dans la deuxième situation, les SSB bloquent RecA, et celle-ci nécessite, pour son chargement, l’intervention de protéines intermédiaires regroupées sous le terme de RMP (pour Recombination Mediator Protein, cf. ci-dessous). De plus, lors d’une réaction d’échange de brin, les SSB se fixent sur le brin déplacé, favorisant ainsi la réaction d’échange (Lavery & Kowalczykowski 1992). Chez S. pneumoniae, il y a donc 2 SSBs. La purification et la caractérisation de ces protéines ont permis de montrer que SsbA a un comportement similaire à celui de SSB d’E. coli, alors que SsbB semble différer, notamment en ce qui concerne l’affinité et le mode de fixation sur l’ADNsb (Steffen & Bryant 2001)(Hedayati et al. 2005)(Grove et al. 2005)(Grove & Bryant 2006). L’hypothèse est que SsbA aurait un rôle général car elle est exprimée de manière constitutive et est essentielle et que SsbB, étant spécifique de la compétence, aurait évolué pour être spécifiquement

48 impliquée dans la recombinaison homologue lors de la transformation, mais ceci reste toutefois à confirmer.

Chez E. coli, de nombreux procédés aboutissent à la recombinaison homologue par RecA, chacun de ces procédés fait intervenir une RMP différente (cf. Figure 14) (Kowalczykowski 2000). Par exemple, la protéine RecB est la RMP impliquée dans le chargement de RecA nécessaire à la réparation par recombinaison homologue des cassures double-brin chez E. coli. Dans ce cas, il y a d’abord reconnaissance des extrémités par le système RecBCD. Celui-ci a une action hélicase et endonucléase qui permet la création d’ADNsb à partir de la cassure et charge RecA. Le filament RecA-ADNsb peut alors envahir le chromosome frère, rechercher une zone homologue et créer une jonction de Holliday qui sera résolue par le système RuvABC. Parmi ces protéines RuvA reconnait la jonction, RuvB catalyse la migration de branches et RuvC est la résolvase.

Le système RecFOR est lui impliqué dans la réparation par recombinaison homologue lors de gap sur l’ADN chromosomique (Morimatsu & Kowalczykowski 2003). Le mécanisme de formation de filaments RecA-ADNsb médié par RecFOR peut remplacer celui de RecBCD si celui-ci est déficient (Ivancić-Baće et al. 2003).

Chez S. pneumoniae, les orthologues du système RecBCD sont les protéines RexAB. Ce système n’est pas induit durant la compétence et n’est pas requis lors de la transformation (Rimini et al. 2000)(Halpern et al. 2004). Ceci semble cohérent avec le fait que l’ADN internalisé est déjà sous forme simple-brin, l’intervention d’un complexe enzymatique tel que RecBCD n’est donc pas nécessaire. Le système RecFOR existe chez S. pneumoniae mais des mutants de ce système présentent un taux de transformation normal, il n’est donc pas impliqué dans la recombinaison homologue lors de la transformation génétique (Claverys et al. 2009).

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Figure 13 : Modèle général de la recombinaison homologue.

(tiré de (Kowalczykowski 2000)) Le modèle représenté est celui de la réparation des cassures double-brin. Ce modèle est applicable chez de nombreux organismes. Le texte entre parenthèses désigne les protéines d'E. coli actives à l'étape indiquée. Les lignes bleu clair indiquent l’ADN néo-synthétisé.

Une seule protéine connue pour agir lors de la recombinaison chez E. coli a été impliquée dans la recombinaison lors de la transformation génétique chez S. pneumoniae. Il s’agit de l’orthologue de RecG dont le gène avait initialement été nommé mmsA car le mutant présentait une sensibilité accrue au Méthyl Méthane Sulfonate (MMS) (Martin et al. 1996). Chez E. coli, il a été montré que cette protéine permet la migration des branches dans les jonctions de Holliday (McGlynn & Lloyd 2002). Chez S. pneumoniae, un mutant recG- présente un déficit de transformation d’un facteur 5-6 et il a été avancé que RecG pourrait permettre l’extension de l’hétéroduplex et qu’une résolvase serait impliquée dans la résolution de l’intermédiaire formé (Martin et al. 1996). Des expériences in vitro menées en 2002 avec

50 les protéines purifiées RecG et RecA de S. pneumoniae montre qu’effectivement, RecG promeut l’échange de brins entre un ADNsb linéaire et un plasmide double-brin homologue (dont un brin porte une coupure) pour donner un ADNdb linéaire et un plasmide simple-brin. Cependant les auteurs précisent que cette réaction est peu efficace et supposent qu’il manque, dans leur réaction, une protéine (RMP) catalysant le chargement efficace de RecA (Hedayati, Steffen, & Bryant 2002).

Ainsi, les protéines habituellement impliquées dans le chargement de RecA pour la recombinaison homologue ne sont pas induites en compétence et ne sont pas nécessaires à la transformation. Ceci permet d’avancer l’hypothèse que la recombinaison homologue lors de la transformation est, certes médiée par RecA, mais avec des partenaires spécifiques.

A.4.2.2.2. Les protéines nécessaires spécifiquement pour la