Fixation de l’ADN exogène 34 

C’est l’étape initiale de la transformation. La nature de l’ADNdb (i.e. linéaire ou circulaire, hétérologue ou homologue) n’influe pas sur la capacité de fixation par des cellules compétentes de S. pneumoniae (Lacks 1979). L’étape de fixation est définie par le maintien de l’ADN au contact des cellules après lavages doux ou en présence d’ADN compétiteur. Ceci suggère que cette fixation ne résulte pas d’un équilibre et qu’elle a une nature irréversible (Lacks & Greenberg 1976). Toutefois, l’ADN fixé peut être libéré par un traitement à la guanidine-HCl ou au NaOH, ou par agitation vigoureuse des cellules, ce qui prouve que la liaison n’est pas covalente (Morrison & Guild 1973a)(Morrison & Guild

35 1973b). Enfin, il a été montré chez B. subtilis que la fixation de l’ADN est un phénomène saturable ce qui suggère un nombre limité de sites de fixation sur la surface bactérienne (Dubnau & Cirigliano 1972).

Figure 9 : Liaison et entrée de l’ADN pendant la transformation chez S. pneumoniae.

Cette figure (adaptée de (Chen & Dubnau 2004)) montre une structure possible du pore d’entrée chez S.

pneumoniae et le rôle des protéines qui le composent lors de l’entrée de l’ADN. Ccl (CclA ou CilC) est une

peptidase qui mature les protéines ComGC, celles-ci s’agencent sous la forme d’un pseudo-pilus sur ComGA et ComGB et lient l’ADNdb. Celui-ci est ensuite présenté, par ComEA, à EndA, endonucléase membranaire qui dégrade un brin dans le sens 5’ vers 3’. L’ADNsb, extrémité 3’ en tête, passe alors par un pore aqueux formé par ComEC et est entraîné dans le cytoplasme grâce à la translocase ComFA.

A.4.1.1.1. Passage du peptidoglycane : rôle des protéines ComGs

Chez B. subtilis, le locus comG est constitué de sept gènes dénommés comGA à

comGG (Albano, Breitling, & Dubnau 1989)(Albano & Dubnau 1989). Un mutant non polaire

de chacun de ces gènes conduit à une perte totale de la capacité à fixer l’ADN (Breitling & Dubnau 1990)(Chung & Dubnau 1998). Un locus présentant de fortes homologies avec le locus comG a été identifié chez S. pneumoniae. L’opéron dénommé cgl (pour comG-like)

36 (Pestova & Morrison 1998), ou cilD (pour competence-induced locus D) (Campbell et al. 1998) est composé d’au moins six gènes comGA, GB, GC, GD, GE et GF (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSea rch=20023&GeneSearch=cglA).

Les protéines GomGs sont toutes membranaires ou associées à la membrane (Chung & Dubnau 1998) et homologues à des protéines de bactéries à Gram négatif requises pour l’assemblage des pili de type 4 (T4P) et des systèmes de sécrétion de type 2 (T2SS) (pour revue voir (Hobbs & Mattick 1993) ; (Nunn 1999) ; (Chen & Dubnau 2004)).

Chez B. subtilis, il a été montré que ComGA est associée à la face interne de la membrane cytoplasmique. Elle présente un motif NTPase qui pourrait jouer un rôle dans l’assemblage du pore d’entrée, mais ceci reste assez incertain (Chung & Dubnau 1998). De plus, il a été proposé qu’elle soit aussi requise pour le blocage de la réplication et de la division cellulaire lors de la compétence chez B. subtilis (Haijema et al. 2001).

ComGB, qui est une protéine prédite pour avoir trois segments membranaires, est homologue à des protéines impliquées dans l’assemblage des T4P et des T2SS. Elle pourrait, avec ComGA, participer à l’assemblage du pilus et à l’assemblage du pore d’entrée (Chung & Dubnau 1998).

ComGC, GD, GE et GF (et ComGG chez B. subtilis) sont des petites protéines similaires à certaines pilines de N. gonorrhoeae (Seifert et al. 1990) ou de Acinetobacter (Porstendörfer, Drotschmann, & Averhoff 1997), indispensables pour la transformation. Ces prépilines sont caractérisées par un court domaine N-terminal chargé positivement (le peptide leader), une partie centrale hydrophobe et un domaine C-terminal variable. Le peptide leader serait clivé par une peptidase spécifique et les protéines matures seraient exportées vers la surface de la cellule pour former une structure de type pili, le pseudo-pilus (Chung and Dubnau, 1995)(Chung & Dubnau 1998)(Chen & Dubnau 2004).

Chez B. subtilis, la peptidase qui mature les prépilines est nommée ComC (à ne pas confondre avec le gene comC qui code le CSP chez S. pneumoniae) et il a été montré qu’elle était requise pour la translocation de ComGC (Chung & Dubnau 1995). L’orthologue de ComC chez S. pneumoniae est CilC ou CclA (Campbell et al. 1998)(Lee et al. 1999).

Chez B. subtilis, des expériences ont montré que l’ADN ne pouvait pas se lier à des cellules comG- mais pouvait se lier à des protoplastes comG- (Provvedi & Dubnau 1999). Ceci a permis de proposer que le rôle du pseudo-pilus formé par les protéines ComGs est de

37 permettre à l’ADN d’accéder à son véritable récepteur ComEA (cf.

paragraphe suivant A.4.1.1.2) (Provvedi & Dubnau 1999)(Dubnau & Provvedi 2000)(Bergé et al. 2002).

De plus, il semblerait, chez B. subtilis, que la force protomotrice permette des mouvements d’élongation-rétraction du pseudo-pilus, ce qui contribuerait à faciliter l’accès à ComEA pour l’ADN (Maier et al. 2004)(Chen, Christie, & Dubnau 2005).

A.4.1.1.2. La fixation de l’ADNdb par ComEA

Il a été proposé que ComEA soit le récepteur de l’ADN lors de la transformation. Chez

B. subtilis, la protéine ComEA est codée par le premier gène de l’opéron comE composé de 3

gènes comEA, EB, EC. Parmi ces 3 gènes, seuls comEA et comEC sont indispensables à la transformation (Inamine & Dubnau 1995). L’équivalent chez S. pneumoniae, cel (Pestova & Morrison 1998) ou cilE (Campbell et al. 1998), n’est composé que de deux gènes, orthologues de comEA et comEC, tous deux également essentiels pour la transformation. Chez B. subtilis, un mutant comEA présente un déficit de fixation de l’ADN (Inamine & Dubnau 1995). De plus, il a pu être montré que cette protéine, fixée à la membrane par son domaine N-terminal membranaire, possède un domaine de liaison à l’ADN dans sa partie C-terminale, orientée vers l’extérieur de la cellule (Inamine & Dubnau 1995). Cette capacité à fixer l’ADNdb sans spécificité de séquence a pu être démontrée biochimiquement (Provvedi & Dubnau 1999). Toutefois, chez S. pneumoniae, un mutant comEA- présente une capacité de liaison à l’ADNdb résiduelle due à la présence des protéines ComGs (Bergé et al. 2002). Les protéines ComGs faciliterait l’accès de l’ADN à ComEA. De plus, ComEA pourrait interagir directement avec ComEC (pour revue, voir (Claverys, Martin, & Polard 2009)).