La protéine CD36 ne modifie pas l’invasion par P. berghei dans des lignées cellulaires transduites

Afin d’analyser le rôle du récepteur CD36 dans l’invasion par les sporozoïtes de Plasmodium, nous avons comparé l’infection de cellules HepG2/CD36 avec celle de cellules HepG2. La lignée cellulaire HepG2 présente naturellement le récepteur SR-BI à sa surface, permettant ainsi l’invasion par P. berghei (Manzoni et al., 2017). Nous avons donc inhibé l’expression de ce récepteur par siRNA dans les HepG2/CD36 afin de savoir si CD36 pouvait constituer une voie d’entrée alternative pour le parasite.

Nous avons tout d’abord contrôlé l’inhibition de SR-BI par siRNA dans les deux lignées cellulaires grâce à un immunomarquage du récepteur SR-BI à la surface des cellules et une analyse par cytométrie en flux (Figure 35 – HepG2 : A et HepG2/CD36 : C). On observe bien,

dans les deux lignées, un recul de l’intensité de fluorescence moyenne avec l’utilisation de siRNA contre SR-BI (orange) par rapport aux cellules non transfectées (bleu), reflétant une diminution moyenne de 75 % de l’expression protéique de SR-BI.

FIGURE 35 : LA PRESENCE DU RECEPTEUR CD36 N’INFLUENCE PAS L’INFECTION DES CELLULES HEPG2 PAR P. BERGHEI Les cellules HepG2 (A, B) et HepG2/CD36 (C,D) ont été électroporées sans siRNA (ssi) ou avec des siRNA contre CD53 (contrôle d’électroporation) ou SR-BI. L’inhibition a ensuite été analysée par immunomarquage de surface et cytométrie en flux (A,C) en comparant les cellules avec siSR-BI (orange), les cellules sans siRNA (bleu) et les cellules marquées seulement avec l’anticorps secondaire (gris). Les cellules ont ensuite été infectées avec les sporozoïtes de P. berghei exprimant la GFP, 48 heures après électroporation des siRNA

Dans les cellules contrôle HepG2 (Figure 35B), nous constatons, comme attendu, une diminution drastique du nombre de cellules infectées par P. berghei suite à l’inhibition de l’expression de SR-BI, par rapport aux contrôles d’électroporation sans plasmide (ssi) ou avec un plasmide témoin (siCD53). Dans les HepG2/CD36, nous observons le même phénotype avec une forte diminution de l’infection dans les cellules électroporées avec un siRNA contre SR-BI

(Figure 35D). La présence de CD36 ne semble cependant en aucun cas amplifier ou modifier

l’invasion en l’absence de SR-BI ou dans les conditions témoins. Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature (Sinnis and Febbraio, 2002). De façon complémentaire, l’équipe a également montré dans une étude non publiée que la transfection transitoire de CD36 murin ou humain dans des cellules Hepa1-6 ne restaurait pas l’invasion par P. berghei contrairement à CD81 ou SR-BI, après blocage de la voie CD81 par un anticorps (Figure 36- Giulia Manzoni, Unpublished).

FIGURE 36 : LA TRANSFECTION RECEPTEUR CD36 HUMAIN OU MURIN NE RESTAURE PAS L’INVASION DES CELLULES HEPA1-6 PAR P. BERGHEI (G. MANZONI)

Les cellules Hepa1-6 ont été transfectées avec un plasmide codant pour hCD81, hSR-BI, hCD36 ou mCD36, ou transfectées sans plasmide (Mock). Elles ont été infectées 24 heures après transfection avec des sporozoïtes P. berghei GFP en présence d’anticorps bloquant CD81 (MT81). Les cellules infectées ont été quantifiées 24 heures après infection par cytométrie en flux.

L’ensemble de ces résultats montre donc que la protéine CD36 humaine ou murine ne semble pas être suffisante pour permettre l’invasion de P. berghei dans les cellules de lignées hépatocytaires HepG2 ou Hepa1-6.

Ctrl Mock hCD81 hSRBI hCD36 mCD36 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 +anti-CD81 % G F P -p o s it iv e c e ll s

3. Influence du blocage de CD36 dans les hépatocytes primaires murins

Afin d’évaluer le rôle du récepteur CD36 ex vivo chez la souris, nous avons utilisé une seconde technique d’inhibition par anticorps bloquants (sans conservateurs, comme l’azide) sur les hépatocytes primaires murins de souris. Pour comprendre si la présence de CD81 aurait pu masquer la fonctionnalité de CD36 dans l’invasion, nous avons comparé l’infection d’hépatocytes primaires par P. berghei en présence d’anticorps bloquant CD81 (MT81), d’anticorps bloquant CD36 (MF3-ab76521) ou d’un mélange des deux anticorps bloquants.

FIGURE 37 : LE BLOCAGE DU RECEPTEUR CD36 A UNE INFLUENCE VARIABLE SUR L’INFECTION DES HEPATOCYTES PRIMAIRES DE SOURIS PAR P. BERGHEI (GIULIA MANZONI)

Les hépatocytes primaires ont été isolés à partir de souris C57BL/6 (A), BalbC (B), Swiss (C) et C57BL/6 CD36-/- (D). Ils ont ensuite été infectés avec des sporozoïtes P. berghei GFP en présence d’anticorps bloquant CD81 (MT81), d’anticorps bloquant CD36 (MF3-ab76521) ou d’un mélange des deux anticorps. Le nombre de formes exo-érythrocytaires a été dénombré après immunomarquage de la protéine UIS4, 48 heures après l’infection.

Les résultats montrent que pour les souris C57BL/6 et BalbC (Figure 37A, B), le blocage de CD81 ou de CD36 seul n’a aucun effet ou un effet très modeste sur l’infection par P. berghei (Giulia Manzoni, unpublished). Cependant, le blocage simultané avec les deux anticorps montre une diminution importante de l’infection, de façon similaire au blocage de SR-BI dans les HepG2. Pour les souris Swiss (37C), le blocage de CD81 induit une diminution drastique de l’infection mais le blocage de CD36 ne semble pas modifier ce phénomène.

D’autre part, l’équipe a confirmé que les sporozoïtes de P. berghei infectaient efficacement les hépatocytes primaires de souris déficientes pour CD36, comme attendu (Figure

37D) (Sinnis and Febbraio, 2002). A (C57BL/6)

Cependant, la présence d’un anticorps bloquant CD81 sur ces cellules au moment de l’invasion diminue fortement le nombre de formes exo-érythrocytaires (Figure 37D). L’ensemble de ces résultats suggère que la protéine CD36 constituerait une voie d’entrée alternative à CD81 pour P. berghei dans les hépatocytes primaires de souris.

FIGURE 38 : LE BLOCAGE DU RECEPTEUR CD81 DES HEPATOCYTES PRIMAIRES DE SOURIS DEFICIENTES EN CD36 DIMINUE L’INFECTION PAR P. BERGHEI

Les hépatocytes primaires ont été isolés à partir de souris C57BL/6. Ils ont ensuite été infectés avec des sporozoïtes P. berghei GFP en présence d’anticorps bloquant CD81 (MT81), d’anticorps bloquant CD36 (MF3-ab76521) ou d’un mélange des deux anticorps bloquants. Le nombre de formes exo-érythrocytaires a été compté après immunomarquage de la protéine UIS4, 48 heures après l’infection.

Dans la continuité de cette étude, j’ai répété cette expérience chez la souris C57BL/6. Nous avons observé avec surprise qu’en fonction des réplicats, les profils d’infection ne sont pas les mêmes (Figure 38). Dans les expériences A et C, on obtient le même type d’effet que pour les souris Swiss (Figure 37C) avec le seul anticorps CD81 qui induit directement une grande diminution de l’infection. Cependant, l’ajout de l’anticorps CD36 à celui-ci semble avoir un léger effet inhibiteur additionnel par rapport à l’anticorps contre CD81 seul (Figure 38A et C).

Dans le réplicat B, on observe uniquement une diminution importante de l’infection lorsque les deux anticorps contre CD81 et CD36 sont ajoutés simultanément lors de l’invasion

(Figure 38B), de la même façon que pour les souris C57BL/6 de la Figure 37.

Les deux types de profils observés semblent refléter un rôle majeur ou mineur de CD81 en fonction de l’implication de CD36. En effet, lorsque le blocage de CD81 a un grand impact sur l’infection, le blocage simultané de CD36 n’impacte pas ou très peu celle-ci. A l’inverse, lorsque le blocage de CD81 n’influence pas l’infection, c’est le blocage additionnel de CD36 qui va la diminuer drastiquement. En conclusion, ces résultats confirment que CD36 semble impliqué dans l’invasion ex vivo par P. berghei.

A (C57BL/6) R1 B (C57BL/6) R2 C (C57BL/6) R3 Anti-CD81 Anti-CD36 Anti-CD81 Anti-CD36 Anti-CD81 Anti-CD36

o Conclusion et Perspectives

Les cellules hépatocytaires humaines HepG2 ont été transfectées de façon stable avec le récepteur CD36 humain et montrent une forte expression de la protéine dans l’ensemble des cellules. Cependant, la présence du récepteur ne modifie pas l’invasion par P. berghei par la voie dépendante de SR-BI. Lorsque l’on bloque cette voie dans les cellules transfectées avec CD36, on constate également que le récepteur CD36 humain n’est pas utilisé comme voie d’entrée alternative. Une étude précédente de l’équipe fait ce même constat pour le récepteur CD36 murin. CD36 ne constituerait donc pas une voie d’entrée alternative dans les lignées hépatocytaires.

In vivo, le récepteur CD36 semble être impliqué dans l’invasion des hépatocytes de souris par P. berghei et son rôle reste à définir plus précisément. En effet, on observe une contribution importante de ce récepteur à l’infection lorsque le rôle de CD81 semble mineur. A l’inverse, lorsque le rôle de CD81 est prépondérant et que son blocage diminue l’infection de façon importante, le blocage de CD36 ne semble pas avoir d’impact majeur. Ces résultats suggèrent un rôle important de la protéine CD36 dans l’infection par P. berghei ex vivo qui mériterait d’être précisé. Le blocage additionnel de SR-BI au cours de l’infection des hépatocytes primaires murins pourrait apporter des éléments de réponse additionnels.