Caractérisation du rôle de LIMP-2 dans l’invasion o Contexte

Le récepteur LIMP-2 présente de nombreuses similarités structurales avec le récepteur SR-BI, appartenant également à la famille CD36, et est d’ailleurs utilisé pour modéliser ce dernier (Neculai et al., 2013). Pour mémoire, SR-BI est impliqué dans l’invasion par P. vivax et P. berghei (Manzoni et al., 2017), et la structure très semblable de LIMP-2 pourrait également être utilisée par le parasite lors de son entrée. En effet, LIMP-2 est majoritairement lysosomal mais il peut également être membranaire. Deux hélices α hydrophobes de son apex (α5 et 7) interagissent avec le ligand physiologique ß-glucocérébrosidase. LIMP-2 permet ainsi l’internalisation puis la libération de son ligand grâce à un changement de conformation à pH acide dans le compartiment lysosomal (Neculai et al., 2013). Ce mécanisme paraît intéressant pour l’internalisation des sporozoïtes de Plasmodium.

De fait, le récepteur LIMP-2 est impliqué dans différents processus infectieux, autant viraux que bactériens (Vishnyakova et al., 2006; Yamayoshi and Koike, 2011). L’entérovirus 71 utilise ainsi ce récepteur pour son internalisation grâce à 8 acides aminés (AA 144-151 entre les hélices α4 et 5) situés dans la même région que les hélices qui permettent l’internalisation de la ß-glucocérébrosidase (Chen et al., 2012). De plus, LIMP-2 est également impliqué dans le désassemblage de la capside virale au sein de l’endosome grâce à un changement de conformation dû au pH qui permet le transfert de lipides viraux via LIMP-2 (Dang et al., 2014). D’autre part, LIMP-2 permet également l’internalisation du Coxsackievirus A16 (Yamayoshi and Koike, 2011) mais aussi la phagocytose de la bactérie Listeria monocytogenes par les macrophages (Carrasco-Marin et al., 2011).

Enfin, LIMP-2 a été identifié par spectrométrie de masse lors d’une co-immunoprécipitation avec CD81 dans des cultures primaires d’hépatocytes humains lysés au BriJ97 (O. Silvie, E. Rubinstein, 2004 unpublished).

Son homologie avec les autres récepteurs de la famille CD36, ainsi son implication dans l’interaction avec différents pathogènes, nous ont amenés à tester le rôle du récepteur LIMP-2 au cours de l’invasion des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium. En effet, il pourrait avoir un rôle dans l’interaction initiale du parasite avec la cellule, mais également dans la formation de

la vacuole parasitophore, de par ses capacités de changement conformationnel dans un contexte de pH acide comme le lysosome (Neculai et al., 2013).

o Stratégie et résultats

Afin de comprendre la fonction de LIMP-2 au cours de l’infection par les sporozoïtes de Plasmodium, nous avons testé trois siRNA différents afin de pouvoir obtenir une inhibition de l’expression de LIMP-2 dans les cellules hépatocytaires humaines HepG2 et HepG2/CD81. Nous avons ensuite cherché à comprendre si le pourcentage d’infection par Plasmodium berghei et Plasmodium yoelii dans ces cellules modifiées transitoirement était altéré par rapport aux cellules contrôle exprimant une quantité normale de protéine LIMP-2.

1. L’expression de la protéine LIMP-2 est fortement inhibée par siRNA

Dans les cellules HepG2/CD81, l’inhibition de l’expression de la protéine LIMP-2 humaine a été testée en utilisant 3 siRNA différents (Figure 31). La quantité de protéine LIMP-2 totale dans les cellules a été analysée par Western Blot 48 heures après transfection.

FIGURE 31 : INHIBITION DE L’EXPRESSION DE LIMP-2 PAR SIRNA DANS LES HEPG2/CD81

Les cellules HepG2/CD81 ont été électroporées avec les siRNA contre CD53 (contrôle d’électroporation), CD81 LIMP-2 (1, 2 et 3), ainsi que sans siRNA (ssi). Les cellules ont été analysées par Western Blot 48 heures après électroporation avec un anticorps contre LIMP-2 et un anticorps contre CD81 comme contrôle de charge.

Comme attendu, on observe que la protéine LIMP-2 migre à la taille de 54kDA alors que la protéine de contrôle de charge CD81 migre à 26kDA. Le siRNA siCD53 est utilisé comme contrôle négatif de l’inhibition protéique car le silencing de CD53 n’a aucun effet sur l’infection par Plasmodium. SiCD81 a été utilisé comme contrôle positif de l’inhibition d’expression protéique par siRNA, et on observe bien une inhibition important de cette protéine dans la condition siCD81 avec l’anticorps contre CD81. Les siRNA contre LIMP-2 SiLIMP-2-1, -2, -3 ont permis respectivement une inhibition de 65%, 57% et 98% de l’expression protéique par rapport au contrôle de charge, la protéine CD81. C’est donc le siRNA siLIMP-2-3 qui a été choisi pour les expériences d’infection des cellules HepG2/CD81 et HepG2 car l’expression de la protéine semble fortement inhibée en regard de l’importance du dépôt protéique dans cette condition.

2. La protéine LIMP-2 n’est pas impliquée dans l’infection par les sporozoïtes de P. berghei

Afin de comprendre le rôle de LIMP-2 dans l’infection des hépatocytes pas les sporozoïtes de P. berghei, nous avons inhibé l’expression de ce récepteur par siRNA dans les lignées hépatocytaires humaines HepG2. En effet, P. berghei utilise le récepteur SR-BI pour infecter ces cellules (Manzoni et al., 2017). L’inhibition de SR-BI montre, comme attendu, une diminution drastique du pourcentage d’infection par rapport au contrôle négatif siCD53, transfecté avec un siRNA ciblant une protéine non impliquée dans l’invasion (Figure 32A). L’inhibition de l’expression de LIMP-2 dans les HepG2 ne semble en aucun cas modifier le pourcentage d’infection qui semble comparable au contrôle siCD53.

FIGURE 32 : L’INHIBITION DE LIMP-2 DANS LES CELLULES HEPG2 ET HEPG2/CD81 NE MODIFIE PAS L’INFECTION PAR P. BERGHEI

(A) Les cellules HepG2 ont été électroporées avec les siRNA ciblant CD53 (contrôle d’électroporation), SR-BI et LIMP-2. Les cellules ont ensuite été infectées avec les sporozoïtes de P. berghei GFP, 48 heures après électroporation. Le pourcentage de cellules infectées a été analysé par cytométrie en flux 24 heures après l’invasion. (B) Les cellules HepG2/CD81 ont été électroporées avec les siRNA contre CD53 (contrôle d’électroporation), SR-BI ou LIMP-2 ou un mélange de siRNA contre SR-BI et LIMP-2. Les cellules ont ensuite été infectées avec les sporozoïtes de P. berghei GFP 48 heures après électroporation en présence, pour certaines conditions, d’un anticorps 1D6 contre CD81 (ab35026 à 20 µg/ml). Le pourcentage de cellules infectées a été analysé par cytométrie en flux 24 heures après l’invasion.

Nous avons ensuite utilisé le modèle des cellules HepG2/CD81, qui présente les deux récepteurs CD81 et SR-BI à leur surface, afin de comparer le rôle de LIMP-2 vis à vis de ces deux protéines (Figure 32B). Pour cela, nous avons bloqué l’une ou l’autre des voies simultanément au silencing de LIMP-2 : la voie dépendante de CD81 en utilisant un anticorps bloquant ou la voie dépendante de SR-BI en utilisant un siRNA,

Ainsi, dans la partie gauche du graphique où figurent les contrôles, on observe comme attendu que ni le silencing de SR-BI (rouge) ni le blocage de CD81 (bleu) n’a d’impact sur l’infection de P. berghei. Ce n’est que lors du blocage simultané de ces deux voies que l’infection diminue fortement (gris) par rapport au contrôle siCD53, comme attendu (Manzoni et al., 2017).

Dans la partie droite du graphique, les mêmes conditions sont reproduites avec l’ajout d’un siRNA contre LIMP-2. On observe ainsi que l’inhibition de l’expression de LIMP-2 n’a aucune influence sur l’infection par P. berghei lors de l’inactivation des voies CD81 (bleu), SR-BI

(rouge) ou lorsque les deux voies sont actives (vert). Enfin, l’inhibition de LIMP-2, SR-BI et CD81 simultanément induit une diminution importante de l’infection par rapport au contrôle

(gris). Le fait qu’elle ne semble pas aussi importante que lors de l’inhibition de CD81 et SR-BI dans la condition contrôle peut s’expliquer par l’augmentation artificielle du pourcentage de parasite en cas de diminution du nombre de cellules dans le milieu, par toxicité cellulaire, ou encore par une moindre efficacité des deux siRNAs mélangés.

Nous avons donc conclu grâce à ces deux expériences que la protéine LIMP-2 ne semblait pas impliquée dans l’infection des lignées hépatocytaires humaines par Plasmodium berghei via aucune des voies CD81 ou SR-BI dépendantes.

3. La protéine LIMP-2 n’est pas impliquée dans l’infection par les sporozoïtes de P. yoelii

Contrairement à P. berghei, P. yoelii n’utilise que la voie dépendante de CD81 (Silvie et al., 2003). Nous avons donc voulu savoir si le récepteur LIMP-2 pourrait jouer un rôle lors de l’invasion par ce parasite. Nous avons donc reproduit les expériences d’inhibition par siRNA dans les cellules HepG2/CD81 où P. yoelii n’utilise que le récepteur CD81 (Figure 33).

FIGURE 33 : L’INHIBITION DE LIMP-2 DANS DES CELLULES HEPG2/CD81 NE MODIFIE PAS L’INFECTION PAR P. YOELII (L.VINCENSINI) Les cellules HepG2/CD81 ont été électroporées avec les siRNA contre CD53 (contrôle d’électroporation), CD81 et LIMP-2. Les cellules ont ensuite été infectées avec les sporozoïtes de P. yoelii GFP, 48 heures après électroporation. Le pourcentage de cellules infectées a été analysé par cytométrie en flux 24 heures après l’invasion.

Nous avons ainsi pu observer que l’inhibition de l’expression de CD81 entraînait une diminution drastique de l’infection, comme attendu, par rapport au contrôle siCD53. A l’inverse, l’inhibition de l’expression de LIMP-2 ne semble pas influencer le pourcentage d’infection des HepG2/CD81 par P. yoelii. Ces résultats nous permettent donc de conclure que la protéine LIMP-2 ne semble pas impliquée dans l’infection des lignées hépatocytaires humaines par Plasmodium yoelii via la voie dépendante de CD81. S^iC D⁵³ S^iC D⁸¹ S^iL IM^P 2 0.0 0.5 1.0 1.5

*

o Conclusion

L’ensemble de ces données montre qu’en contraste avec la protéine SR-BI, appartenant également à la famille CD36, la protéine lysosomale LIMP-2 ne semble pas être impliquée lors de l’invasion des lignées hépatocytaires humaines par les sporozoïtes de Plasmodium yoelii ou de Plasmodium berghei, quelle que soit la voie d’invasion. En effet, l’infection via les voies dépendante de CD81 ou dépendante de SR-BI ne semble pas être modifiée après l’inhibition de l’expression protéique de ce récepteur, par rapport à l’infection de cellules contrôles.

Il est cependant possible que LIMP-2 ait une fonction lors de l’infection des hépatocytes primaires de souris, ou encore lors de l’invasion des sporozoïtes de Plasmodium à tropisme humain. Ces expériences constitueraient une perspective intéressante à ce projet.

B. Caractérisation du rôle de CD36 dans l’invasion