Chapitre 3 Résultats
3.1 Propriétés morphologiques des JNMs des muscles extraoculaires
afin de déterminer les cascades moléculaires potentielles qui pourraient expliquer ces différences dans la résistance à la maladie.
3.1 Propriétés morphologiques des JNMs des muscles
extraoculaires
La SLA est caractérisée par la dénervation progressive des JNMs des muscles striés, un processus neurodégénératif qui varie selon le type d’unité motrice. Cependant, certains muscles, dont les muscles extraoculaires, sont beaucoup plus résistants à cette dénervation. Deux scénarios menant à cette résistance peuvent émerger. D’une part (1), les muscles extraoculaires, possèderaient des mécanismes intrinsèques adaptés leur permettant de résister à cette dénervation, ou (2) les muscles extraoculaires seraient tout simplement touchés plus tardivement dans la maladie. Ainsi, pour investiguer ces différentes possibilités, une analyse morphologique des JNMs des muscles extraoculaires est primordiale. Nous prévoyons qu’à un stade tardif de la maladie, dû aux mécanismes intrinsèques, la morphologie des JNMs sera conservée.
Afin d’investiguer les altérations morphologiques des JNMs des muscles extraoculaires, il a été nécessaire d’isoler les préparations neuromusculaires à un stade avancé de la maladie, soit, lorsque les souris SOD1G37R ont perdu entre 20%-30% de leur poids maximal et lorsqu’une
paralysie prononcée des membres inférieurs est observée, soit, en moyenne, vers 530 jours postnatals. Dans la figure 3.1, on peut observer les différents éléments de la JNM de souris sauvage (WT) ainsi que des JNMs de souris porteuses de la mutation (SOD1G37R) au stade symptomatique
Figure 3.1 Morphologie non atteinte des JNMs dans les muscles extraoculaires au stade symptomatique tardif de la SLAt
(A) Images aux confocales des différents éléments de la JNMs des muscles extraoculaires chez la souris sauvage (WT) et chez la souris mutée (SOD1G37R) au stade symptomatique (P530). Les récepteurs postsynaptiques ont été marqués
en rouge à l’aide de la toxine α-bungarotoxine, la terminaison axonale a été marquée en vert grâce aux anticorps NFM et SV2 et l’élément glial a été marqué en cyan grâce à l’anticorps S100 β. (B) Histogramme le pourcentage moyen ± SEM des JNMs qui sont mono (vert pâle) ou polyinnervé (vert foncé), possédant un recouvrement de la plaque motrice complet (gris), incomplet (rose) ou entièrement dénervé (rouge) ainsi que la présence d’extension gliale (bleu) des
Muscles extraoculaires WT SOD1 G37R NFM-SV2 NFM-SV2
Présynaptique Postsynaptique Cellule gliale (CSPs)
α-BTX α-BTX S100β S100β Fusion 10μm 10μm
A
B
SOD1 G37R WT 0 5 10 15 20 40 60 80 100 120 % of JNM s Polyinnervation Monoinnervation Complète Incomplète Dénervée Extension glialeType d’innervation présynaptique
Recouvrement plaque motrice
Composante gliale
SOD1G37R: N = 5; n = 312
Tableau 3.1 Analyse morphologique des JNMs des muscles extraoculaires
Élément
présynaptique postsynaptique Élément Élément Glial
Monoinnr-
vation Polyinner-vation
Récepteurs
ectopiques (um) plaque motrice Recouvrement CSPs Extension (avec prolongement axonal) Extension terminale (sans prolongement axonal)
5 10 Complet Partiel Dénervé
WT 92.44 % ± 0.89 % ± 4.19% 7.56 % 3.1 % 8.3 ± 0.68 % 1.6 ± ± 0.79% 99.21% 0.79% ± 0.79% 4.6 % ± 2.6 %
SOD1G37R 95.83 % ±
0.89% ± 0.75% 3.95 % 3.2 % 9.1 ± 0.60 % 0.60 ± 95.4% ± 1.8% 3.4 % ± 2.0% 1.14 % ± 0.50 7.1 % ± 2.0%
Analyse morphologique des JNMs des éléments présynaptiques, postsynaptiques et gliaux des JNMs des muscles extraoculaires chez la souris sauvage (WT : N = 3, n = 155) et chez la souris mutée (SOD1G37R : N = 5, n = 312) au stade symptomatique (P530) représenté en pourcentages moyens ± SEM. Valeur non disponible en gris.
Une analyse plus exhaustive des différents éléments de la JNM est illustrée dans l’histogramme de la figure 3.1B dont les valeurs de cette analyse se trouvent dans le tableau précédent (tableau 3.1). Dans cet histogramme, trois éléments principaux ont été analysés : l’innervation des JNMs (vert : monoinnervation ou polyinnervation), le recouvrement de la plaque motrice par la terminaison axonale (gris : recouvrement complet, rose : recouvrement partiel, rouge : plaque motrice dénervée) ainsi que la présence d’extension gliale des CSPs.
Dans les sections suivantes (3.1.1 à 3.1.3), les différents éléments mentionnés plus haut seront analysés plus profondément. Ces analyses morphologiques de la JNM sont effectuées en utilisant les critères d’analyse publié précédemment par notre laboratoire et qui figurent dans le tableau 2.1 de la section Matériel et Méthode (Arbour, Tremblay et al. 2015, Tremblay, Martineau et al. 2017, Martineau, Di Polo et al. 2018). Sommairement, via les images obtenues par microscopie confocal, l’innervation sera évaluée en regardant la provenance et le nombre de terminaison axonal innervant la plaque motrice. Le recouvrement de la plaque motrice sera déterminé en évaluant le recouvrement de cette dernière avec la terminaison axonale : totalement recouverte (complète), partiellement recouverte (partielle) ou exempt de terminaison axonale
3.1.1 Innervation des JNMs des muscles extraoculaires
Le type d’innervation des JNMs est un élément primordial à investiguer dans un premier temps. Sachant que les muscles extraoculaires peuvent être naturellement polyinnervés (1) observe-t-on une différence dans le ratio monoinnervation / polyinnervation entre les JNMs des souris WT ou SOD1G37R? Sachant que lors des processus de dénervation, la terminaison axonale
des JNMs innervées adjacentes vont faire des extensions pour aller innerver les JNMs dénervées (2) est-il possible d’observer cet élément chez les JNMs des muscles extraoculaires? Dans les muscles extraoculaires WT, on observe une polyinnervation de 7.6% ± 4.2 % ainsi qu’une monoinnervation de 92.4% ± 4.2 % des JNMs (N = 3; n = 155), similairement aux JNMs des muscles extraoculaires des souris SOD1G37R, dans lesquelles on observe respectivement 3.95 % ±
0.75% et 95.83% ± 0.89 % de polyinnervation et de monoinnervation (N = 5; n = 312). Ainsi, on n’observe aucune différence dans le ratio d’innervation des JNM et, tout comme la souris WT, la polyinnervation semble être davantage axonale plutôt que provenant d’une plaque motrice adjacente (données non présentées).
3.1.2 Innervation de la plaque motrice des JNMs des muscles
extraoculaires
Un second élément primordial à investiguer est l’état d’innervation de la JNM reflété par le recouvrement de la plaque motrice par la terminaison axonale. Aussi représentatif de l’état de la JNM, nous avons analysé la distribution et le regroupement des récepteurs nicotiniques postsynaptiques. Est-il possible dans un premier temps d’observer le phénomène de dénervation et/ou la présence de récepteur ectopique qui sont deux éléments observés dans la SLA ou lors du vieillissement normal (Tremblay, Martineau et al. 2017)? Tout comme pour l’innervation axonale des JNMs, on n’observe aucune différence entre les JNMs WT et SOD1G37R au niveau des
altérations postsynaptiques. En effet, chez les souris WT, 99.21 % ± 0.79% et 0.79 % ± 0.79% des plaques motrices des JNMs sont respectivement complètement innervées ou partiellement innervées (N = 3; n = 155). Similairement, chez les souris SOD1G37R, on observe 95.4 % ± 1.8 %,
dans les JNMs dans la SLA et lors du vieillissement (Arbour, Tremblay et al. 2015, Tremblay, Martineau et al. 2017). Chez les souris WT, 8.3 % ± 3.1 % ainsi que 1.6 % ± 0.68 % (N = 3; n = 155) des JNMs possédaient respectivement des récepteurs ectopiques, valeur similaire chez les JNMs de SOD1, qui possèdent respectivement 9.1 % ± 3.2 % et 0.60 % ± 0.60 % (N = 5; n = 312). En ce sens, aucune différence dans l’organisation des récepteurs postsynaptiques ainsi que dans le recouvrement de plaque motrice n’a été observé entre les souris mutées et leurs contrôles.
3.1.3 Morphologie gliale des JNMs des muscles extraoculaires
Le dernier élément morphologique primordial investigué est la présence d’extension gliale qui assure les processus de réinnervation lors de dénervation de la JNM. Plusieurs éléments peuvent en découler : dans un premier temps, lors de la dénervation des JNMs, les CSPs sont-elles en mesure de faire des extensions afin de promouvoir la réinnervation? Bien que ces extensions soient présentes, semblent-elles organisées et dirigées vers une JNM innervée adjacente ou sont-elles désorganisées comme observées précédemment (Arbour, Tremblay et al. 2015, Martineau, Arbour et al. in prep)? Dans les JNMs des muscles extraoculaires, aucune extension terminale n’a été observée ni chez les WT, ni chez les SOD1. Très peu d’extensions axonales ont été observées, soit 4.6 % ± 2.6 % chez les WT, valeur similaire chez les SOD1 dans lesquels 7.1 % ± 2.0% de JNM. Ainsi, malgré l’âge avancé de la maladie, aucun processus dégénératif ainsi que de réparation a été observé dans le muscle extraoculaire suggérant des JNMs stables même durant un stade avancé de la SLA.
En résumé, le maintien de la morphologie des différents éléments de la JNM à un stade tardif de la SLA dans les muscles extraoculaires est observé. Cependant, ce phénomène est-il dû à une atteinte plus tardive de ces muscles ou serait-il dû à la capacité des différents éléments de la JNM de maintenir leur fonction malgré les altérations moléculaires engendrées par la maladie?