Préparations neuromusculaires des muscles oculomoteurs

Chapitre 2 Matériel et Méthode

2.2 Préparations neuromusculaires des muscles oculomoteurs

2.2.1 Dissection générale

Afin d’assurer le bon déroulement du prélèvement de la préparation neuromusculaire des muscles oculomoteurs, une solution saline physiologique Ringer a été utilisée. Cette solution contient les composés suivants (mM) : 110 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 25 NaHCO2, 2 CaCl2, 11

glucoses, 0.3 glutamate, 0.4 glutamine, 5 BES (C6H15NO5S), 4.34 X 10-7 thiamine décarboxylase

et de 0.036 choline chloride. Les expériences ont été effectuées à 27 ± 2°C sous une perfusion constante de solution oxygénée (95% O2, 5% CO2) à un pH de 7.4.

Pour isoler adéquatement les muscles oculomoteurs murins, dans un contenant profond rempli préalablement de Silgard (Dow Coring, Silicone Elastomer Kit) :

1) Stabilisez la tête de la souris en épinglant le museau et proche des oreilles.

2) Retirez la peau du crâne tout en gardant une certaine quantité de peau autour des paupières (bien humidifier).

3) Enlevez les muscles des joues puis retirez tous les os du crâne jusqu’à l’os nasal grâce aux ciseaux robustes prévus à cet effet (FST, 15124-12).

4) Retirez le cerveau en coupant proche du tronc cérébral en faisant bien attention de ne pas toucher tous les nerfs se trouvant au fond de la boite crânienne.

5) Coupez la peau en dessous de l’os supérieur et de l’arcade zygomatique. Ceci va permettre de faire une fente assurant ainsi de perfuser de manière constante les muscles oculomoteurs pour le restant de l’extraction.

7) Effectuez un trou au centre de la cavité du crâne à l’aide d’une mèche (Meisinger).

8) Afin de procéder à une dissection plus fine, détachez la préparation neuromusculaire des muscles oculomoteurs en coupant de manière transverse au niveau du tronc cérébral et déplacez dans un contenant de volume plus petit.

9) Afin de s’assurer d’un niveau de tension musculaire adéquat des muscles oculomoteurs, placez plusieurs épingles au niveau de la paupière inférieure et supérieure des yeux gauche et droit ainsi que dans l’orifice traversant le palais.

10) Retirez les os recouvrant les muscles oculomoteurs ainsi que suivant les tissus mous les recouvrant afin d’exposer uniquement les muscles suivants : les rectus droits supérieur, latéral, médial, inférieur, les rectus obliques supérieur, inférieur et les muscles des paupières inférieur et supérieur.

lavez à trois reprises pendant 5 minutes avec une solution de PBS.

13) Pour l’extraction des protéines, coupez

individuellement chaque rectus et les congelez rapidement dans l’azote liquide.

2.2.2 Préparation des tissues pour l’imagerie calcique

Afin d’obtenir une préparation neuromusculaire adéquate pour effectuer les expériences d’imagerie dynamique, le muscle oculomoteur supérieur gauche a été isolé dû à sa facilité d’accès. Ceci permet donc de diminuer les manipulations effectuées et ainsi de réduire le risque d’endommager la préparation neuromusculaire.

1) Pour ce faire, répéter les étapes 1 à 7 mentionnées ci-dessus 2) Afin de stabiliser au maximum et d’assurer une

immobilité adéquate de la préparation, un deuxième orifice est nécessaire. Retirez complètement l’œil droit ainsi que tous les tissus dans l’arcade zygomatique droit jusqu’à l’exposition des os maxillaire et zygomatique.

3) Effectuez une deuxième incision à travers l’os

Avant Après Latéral Supérieur Médial Inférieur

2.3 Marquage immunohistochimique des JNMs

Les différents compartiments de la JNM des muscles oculomoteurs ont été marqués grâce à un marquage immunohistochimique, soit via l’utilisation d’anticorps reconnaissant des antigènes spécifiques aux protéines de la JNM. Ces muscles ont été fixés pendant 15 minutes dans de la paraformaldéhyde 4% dilué dans une solution de PBS (en mM : 137 NaCl, 2.7 KCl, 10 Na2HPO4,

2KH2PO4) à température ambiante. Les préparations ont été par la suite perméabilisées à l’aide

d’une solution froide de 100% méthanol pendant 6 min à -20°C. Afin d’éviter un marquage non spécifique des anticorps utilisés, chaque préparation a été incubée pendant 20 min avec une solution contenant 10% normal donkey serum dans du PBS contenant 0.01% Triton X-100 pour 20 min à température ambiante.

Les cellules de Schwann périsynaptiques ont été marquées avec l’anticorps anti-S100β lapin (1 :250, Dako, Z031) pendant une durée de deux heures. Les axones et les éléments présynaptiques terminaux ont été marqués avec respectivement les anticorps anti-neurofilament M [NF-M] poulet (1 :2000, Rockland Immunochemicals, 212-901-D84) et anti-synaptique vesicular protein 2 [SV2] souris IgG1 (1 :2000, Developmental Studies Hybridoma Bank) pour une durée de 2 heures également.

Les muscles ont été incubés par la suite avec les anticorps secondaires suivants : chèvre anti-souris IgG1 Alexa 488 (1 :500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-545-205), âne anti-poulet Alexa-488 (1 :500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, 703-545-155), âne anti- lapin Alexa-647 (1 :500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, 711-605-152) pendant 1 heure. Finalement, les récepteurs postsynaptiques cholinergiques nicotiniques (nAChRs) ont été marqués avec la toxine α-bungarotoxine conjuguée à l’Alexa-594 (2.0 μg/ml, Invitrogen, B13423). Toutes les incubations avec les anticorps ont été effectuées dans une solution de PBS contenant 0.01% Triton X-100 et 2% « normal donkey serum » à température ambiante et entre chaque différente incubation, les muscles ont été rincés à trois reprises avec une solution de PBS contenant 0.01% Triton X-100 pendant 5 minutes. Tous les muscles ont été montés sur lame avec le Prolong Gold antifade reagent DAPI (Invitrogen, P36935). Ce milieu de montage contenant spécifiquement du

Les différents éléments de la JNM ont été imagés via le confocal Zeiss LSM 880. L’objectif à l’huile 63X (Plan-APOCHROMAT, 1.40 NA DIC M27) a été utilisé. Le laser Argon, (455 nm) excite l’élément présynaptique marqué par les molécules Alexa-488 (488 nm), qui, à leur tour, émettent des photons détectés par une fenêtre spectrale se situant entre 509-571 nm. Les lasers HeNe1 (543 nm) et HeNe2 (633 nm) vont respectivement exciter les éléments postsynaptiques, marqués par les molécules Alexa-594 et les éléments gliaux marqués par les molécules Alexa-647. Les photons émis par l’excitation des Alexa-594 (594 nm) ou des Alexa-647 (647 nm) sont détectés par les fenêtres spectrales suivante : 585-631 nm ainsi que 655-756 nm. Finalement, le laser Argon (351 nm) excite le DAPI (405 nm) marquant les noyaux et les photons émis ont été détectés avec une fenêtre spectrale de 410-491 nm. Des images de 640 X 640 pixels ont été acquises à une vitesse de 3.30 μsec par pixel ainsi qu’un filtre Kalman pour minimiser le bruit de fond (Tremblay, Martineau et al. 2017). Sur chaque JNM, l’acquisition de plusieurs images a été effectué. Ceci a permis de créer un montage des images consécutives (intervalle en z de 10 μm) d’une même JNM permettant ainsi d’effectuer une analyse morphologique adéquate.

2.4 Analyse morphologique des JNMs

L’analyse morphologique des JNMs a été effectuée sur plusieurs critères publiés antérieures (Darabid, Arbour et al. 2013, Arbour, Tremblay et al. 2015, Tremblay, Martineau et al. 2017).

Tableau 2.1 Critères d’évaluations de la morphologie des différents éléments de la JNM

Critères Description Exemple

Pr és yna pt ique Recouvrement plaque motrice

Dénervation complète : lorsque la plaque motrice, n’a aucun recouvrement de la terminaison axonale

Partiellement recouverte : lorsque la plaque motrice est recouverte à 90% et moins par la terminaison axonale. Totalement recouverte : lorsque la plaque motrice est recouverte à plus de 90% par la terminaison axonale.

État d’innervation

Monoinnervation : lorsque la plaque motrice est innervée par une seule et unique terminaison axonale.

Polyinnervation : lorsque la plaque motrice est innervée par plusieurs terminaisons axonales.

Pos ts yna pt ique Récepteurs ectopiques

Lorsque sur la même fibre musculaire on retrouve deux regroupements de récepteurs nAChR d’une distance minimale de 5 µm.

Faible regroupement

Lorsque la plaque motrice ressemble à celle retrouvée dans une JNM immature, on observe un marquage des récepteurs nACh mal défini ainsi que leur distribution non uniforme.

l Extensions

gliales

Lorsqu’une CSP va créer une extension fine au-delà de la plaque motrice de plus de 10 µm exempt de terminaison