Détermination du profil d’expression protéique

Afin de déterminer les différents profils d’expression des protéines des échantillons désirés, les techniques de Tandem Mass Tag (TMT) couplé à la spectrométrie de masse ainsi que divers outils bio-informatiques ont été utilisées. Toutes les expériences en lient avec la spectrométrie de masse ont été effectuées par Marie-Soleil Gauthier et Benoît Coulombe (IRCM) tandis que l’analyse bio-informatique a été effectuée par Rachel Nadeau et Mathieu Adam-Lavallée (Université d’Ottawa).

2.7.1 Digestion Tryptique

11 plex ». Brièvement, les ponts disulfures ont été réduits dans 5 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) pendant 1h à 55 °C. Les cystéines ont été alkylées dans 15 mM iodoacetamide pendant 30 min à TP dans le noir. Les protéines ont été précipitées dans l’acétone toute la nuit puis resuspendues dans le Triethylammonium bicarbonate (TEAB). Finalement, les protéines ont été digérées toute la nuit à 37 °C avec de la Trypsin.

2.7.2 Marquage TMT

Le marquage TMT a été effectué sur les peptides de chaque échantillon individuel ainsi que dans les échantillons contrôles en suivant les instructions du manufacturier. Les échantillons ont été distribués de manière aléatoire dans deux « 10-plex label sets » avec un échantillon contrôle. Le « TMT 11-plex labeling reagents » (0.8 mg) a été dessous dans 52 μL anhydrous acétonitrile (ACN). Chaque échantillon a été combiné avec son « TMT 11-plex labeling reagents » et incubé pendant 1h à température pièce. La réaction a été interrompue avec 5% hydroxylamine. Les échantillons ont par la suite été asséchés grâce à un aspirateur à haute vitesse (anglais : « speed-

vac »). Les échantillons ont été dissous dans une solution de 5% acide formique, rassemblé dans 2

« 11-plex » et séparé en 10 fractions avec « Pierce High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation

Kit ».

2.7.3 Analyses LC-MS/MS

La technique de la quantification via marquage isobarique TMT permet d’analyser 10 échantillons biologiques ainsi que le contrôle dans une expérience de spectrométrie de masse. Les peptides ont été injectés dans une colonne C18 75 μm i.d. × 150 mm Self-Pack installés dans le système Easy-nLC II (Proxeon Biosystems). Le tampon utilisé pour la chromatographie est l’acide formique à 0.2% (tampon A) et une solution comprenant un ratio de 90% d’acétonitrile / 0.2% d’acide formique (tampon B). Les peptides ont été élués dans deux gradients à deux pentes à un débit de 250 nL / min. Le Tampon B est le premier à augmenter de 1 à 40% en 100 minutes et puis de 40 à 85% en 10 minutes. Le système HPLC a été couplé au spectromètre de masse Orbitrap

linéaire avec une valeur cible à 2e4 et une énergie de collision normalisée à 28. Les ions cibles sélectionnés pour la fragmentation ont été exclus pendant 20 secondes

2.7.4 Identification des Protéines

Un fichier Rhermo RAW a été convertie en format mzML utilisant msConvert (Adusumilli and Mallick 2017) provenant de « ProteoWizard toolkit » (Chambers, Maclean et al. 2012). Le fichier généré par LC-MS/MS mzML contient les séquences protéiques. Une recherche de ces séquences en utilisant l’algorithme Comet (Eng, Jahan et al. 2013) dans la base de données a été effectuée dans les protéines murines « Swiss-Prot » révisées d’UnitProt (téléchargée le 01-04- 2019). La recherche a été exécutée avec une tolérance de masse des ions précurseurs de 20 ppm, ne considérant que les peptides entièrement tryptiques et avec un maximum de 2 clivages. Par la suite, la carbamidométhylation des cystéines et des modifications des lysines par le TMT11 a été considérée comme des modifications fixes et l’oxydation de méthionine comme une modification variable. La confirmation de l’identité des peptides et des protéines a été évaluée via PeptideProphet (Keller, Nesvizhskii et al. 2002) et ProteinProphet (Nesvizhskii, Keller et al. 2003). L’identification est considérée fiable a avec un taux de « False Discovery Rate » inférieur à 1%.

2.7.5 Quantification des Protéines

Les peptides et les protéines ont été quantifiés en utilisant le logiciel Libra provenant de Trans-Proteomic Pipeline qui extrait l’intensité des ions des rapporteurs du TMT (Deutsch, Mendoza et al. 2015). Les intensités des ions rapporteurs individuels ont été normalisées pour ajuster l'intensité totale d'un canal TMT à l'intensité totale moyenne sur les 11 canaux TMT (Plubell, Wilmarth et al. 2017). Les intensités des ions rapporteurs ont ensuite été normalisées par la somme des intensités des ions rapporteurs dans le canal TMT contenant l’échantillon contrôle, afin de permettre une comparaison des valeurs de quantification des protéines entre les expériences TMT. Les valeurs de quantification des protéines dans un canal TMT donné ont été définies comme l'intensité moyenne de ses spectres correspondants dans le canal.

intra-sujet tandis que le phénotype de la souris (WT et SOD1) la variable entre le sujet. Les « p-

value » ont été corrigés en utilisant le test pour les hypothèses multiples Benjamini-Hochberg

(Benjamini and Hochberg 1995). Un test post-hoc Tukey a été performé sur les FDR et les « p-

value » pour déterminer les groupes d’importance. Les protéines significatives possèdent un

intervalle de confiance de 95% ont été reporté.

L’analyse bio-informatiques a permis de déterminer spécifiquement le protéome des différentes conditions. L’ensemble des protéines dans chacune des conditions ont été représentées dans un graphique de type volcano plot via le logiciel Perseus. L’outil InteractiVenn (Heberle, Meirelles et al. 2015) a permis de regrouper dans un diagramme de Venn les protéines différentes statistiquement selon la ou les conditions correspondantes.

2.7.7 Analyse des fonctions

Dans le but d’investiguer les différentes cascades moléculaires et fonctions cellulaires, l’utilisation de quelques outils bio-informatiques ont permis d’effectuer une analyse approfondie. Les GOENRICHISSIMENT ont été déterminé via GOrilla (Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool) (Eden, Navon et al. 2009). Les enrichissements possédant un FDR ≤ 0.05 (false descovery rate) ont été gardé. L’interaction protéine-protéine de protéines dans certaines conditions ont été déterminé grâce au logiciel STRING v11.0 (Szklarczyk, Gable et al. 2019). Certaines fonctions, localisations cellulaires, ainsi que caractéristiques spécifiques (séquence transmembranaire) ont été déterminées grâce à Uniprot (UniProt Consortium 2018). L’analyse des fonctions et des caractéristiques ont été effectuée entre le 14 février 2020 et le 7 mars 2020.