a. Généralités
L’oxygraphie est une technique de mesure de la quantité d’oxygène dissous en milieux gazeux ou liquide. Elle permet d’évaluer la respiration cellulaire et peut être réalisée sur mitochondries isolées, culture cellulaire ou tissu.
L’oxygène dissous peut être mesurée par trois méthodes différentes : chimique, optique ou électrochimique.
La méthode chimique utilise le caractère réactif de l’oxygène. Une succession de réactions produit de l’iode, dosable avec précision. C’est la méthode de référence pour valider les mesures des sondes. Les mesures en continu ne sont pas possibles avec cette méthode.
La méthode optique utilise le phénomène de fluorescence. Sous l’effet d’une diode, les molécules d’oxygène ou une molécule fluorescente (photophore) sont excitées par des photons. La désexcitation de l’oxygène va libérer des photons rouges et entraîner une fluorescence proportionnelle à la concentration en oxygène dissous. Dans le cas du photophore, ce dernier cède les photons à l’oxygène. La fluorescence sera alors inversement proportionnelle à la concentration en O2 (phénomène d’extinction). Ce type d’appareil ne nécessite pas de calibration et est indépendant de la salinité et de la température du milieu.
La méthode électrochimique utilisant la conversion en signal électrique de la teneur en O2 via une électrode (polarographie) est la méthode utilisée dans notre travail.
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b. Mesure par polarographie : Electrode Clark
Figure 34.Electrode de Clark.
Cette électrode (Figure 34) mise au point par le Pr. Leland CLARK en 1953, est constituée d’une cathode de platine et d'une anode circulaire en argent, entre lesquelles circule un courant de 0,7 V. Elle utilise le potentiel d'oxydoréduction de l’O2 /H2O (ε = 0,81 V). L’oxygène dissous est ionisé au niveau de la cathode (réaction 1) alors que l’anode en argent est oxydée.
O2 + 4 H+ + 4 e-→ 2 H2O (Eq1) 4 Cl-+ 4 Ag → 4 AgCl + 4 e- (Eq2)
L’oxygène est réduit en eau en captant les électrons émis à l’anode. Le courant créé par la circulation d’électrons entre les deux électrodes est proportionnel à la concentration en oxygène. L’électrode, dans le bain d’électrolytes, est séparée du milieu de mesure par une membrane perméable à l’O2 mais imperméable à l’eau. La mesure dépend de la vitesse de diffusion de l’O2 à travers la membrane. Cette électrode permet de mesurer en continu la concentration d’oxygène dissous. Elle présente l’inconvénient de consommer de l‘oxygène, nécessitant de maintenir une agitation afin de générer un courant d’eau.
Afin de garantir une température d’expérimentation stable, l'échantillon est placé dans un puits entouré d'une double paroi permettant la circulation d’eau maintenue à température constante. Enfin, le puits doit pouvoir être fermé avec un bouchon afin de limiter les échanges de gaz entre l'échantillon et l'atmosphère. Un orifice étroit est souvent aménagé dans le bouchon afin de permettre l'injection de drogue(s) sans nécessiter l'ouverture de la cuve réactionnelle.
c. Intérêts de la mesure de la respiration sur tissus perméabilisés.
La mesure de la respiration mitochondriale permet une évaluation physiologique de la fonction mitochondriale (Figure 35). Contrairement aux mesures des activités d’enzymes de la matrice (citrate synthase) ou de la chaine respiratoire (complexes) mitochondriales, cette approche permet d’évaluer l’interaction entre les complexes de la chaîne. Cette technique permet de mesurer la respiration de mitochondries intactes, isolées ou au sein de cellules perméabilisées telles que les fibres musculaires. Les techniques de respiration sur mitochondries isolées permettent de n’étudier que la réponse mitochondriale et présente des avantages certains à ce titre. Cependant, la perméabilisation de la membrane plasmique présente également des avantages. La mitochondrie interagit avec son environnement cellulaire. Le contrôle du flux oxydatif semble notamment dépendant d’interactions avec le cytosquelette ou de la mise en jeu de navettes liées la compartimentation comme la CK (Kay, Nicolay et al. 2000, Kunz, Kudin et al. 2000). La préservation de l’organite dans son environnement cellulaire garantit les interactions avec le cytosquelette, le noyau (important puisque la synthèse de la plupart des protéines mitochondriales en dépend), le réticulum endoplasmique et les systèmes de transfert d’énergie. D’ailleurs, le flux mitochondrial montre des propriétés différentes selon la préparation de mitochondries isolées ou l’utilisation de tissu perméabilisé, concernant l’affinité pour l’ADP ou le comportement du complexe IV notamment. De plus, la technique de perméabilisation permet d’étudier la population mitochondriale d’un tissu, indépendamment des différences de morphologie ou de qualité des mitochondries, contrairement à la technique d’isolement des mitochondries qui peut détériorer les mitochondries les plus fragiles mais également induire un biais en sélectionnant une certaine sous-population mitochondriale par rapport à une autre, par l’étape de centrifugation. Enfin, la respiration sur tissu perméabilisé nécessite moins de matériel biologique, les mitochondries proviennent d’un même tissu homogène quand les techniques d’isolement requièrent des quantités importantes de cellules (> 200. 106) ou de tissu (50 0mg) conduisant à rassembler les mitochondries de tissus différents (par exemple de différents types de muscles). De plus, cette moindre taille d’échantillon rend possible d’étudier ex vivo des tissus issus de biopsie, y compris chez l’Homme.
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Figure 35. Principe de la perméabilisation.La cellule est représentée avant (a) et après (b) perméabilisation de la membrane plasmique. Le traitement utilise un agent chimique, tel que la saponine, capable de former des complexes avec le cholestérol, composant très abondant de la membrane plasmique. L’interaction avec le cholestérol induit une perte d’intégrité (perméabilisation) du sarcolemme. Le cytosol est vidé de ses éléments solubles. Un équilibre s’établit entre l’espace intracellulaire et le milieu environnant. Le contenu en cholestérol des organites et des membranes intracellulaires (telles que celles composant la mitochondrie) est moindre. A la concentration utilisée, seules les membranes cellulaires sont perméabilisées, permettant l’étude de la fonction mitochondriale au sein de son environnement d’organites.